前編：等電点電気泳動電気泳動とは・・・ある溶液に一対の電極を入れて直流電流を流したとき、溶液中の荷電粒子が自分のもつ電荷と反対の極に向かって移動する現象 1808年ロシアの物理学者Reussが水中の粘土粒子で発見 1930年代スウェーデンの化学者Tiseliusが電気泳動装置を考案それを用いた多くの研究により1948年ノーベル化学賞受賞電気泳動現象を利用して、電荷・分子量・形が異なる分子を分離・分析・分取することができるゲルマトリックス中の分子の移動－＋－＋－－＋・プラス電荷分子は陰極へ・マイナス電荷分子は陽極へ・分子量が低いほど移動度が大きい・同じ分子量でも形によって移動度が異なる分子ふるい効果電気泳動の分類 A. 支持体・セルロースアセテート膜・ゲルアガロースゲルポリアクリルアミドゲル・ポリマー入り緩衝液・無担体電気泳動の分類 B. 形態・方法・スラブゲル電気泳動・サブマリン電気泳動・パルスフィールド電気泳動・等電点電気泳動・キャピラリー電気泳動・フリーフロー電気泳動二次元電気泳動（2D-PAGE） TWO-DIMENSIONAL POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS 一次元目：等電点の違いによる分離二次元目：分子量の違いによる分離異なった原理に基づいた2種類の電気泳動を組み合わせることにより、一度に数千種類ものタンパク質を分離することができる二次元電気泳動の実験の流れサンプル調整一次元目の泳動（IEF) 二次元目の泳動（SDSｰPAGE) スポットの検出と泳動結果の解析等電点電気泳動（IEF = Isoelectric Focusing）等電点の差によってタンパク質を分離する（isoelectric point : pI) 両性分子の純電荷がゼロになるpH値溶液のpHにより荷電状態が変化する分子タンパク質は両性分子の性質を持つタンパク質を構成するアミノ酸の残基は酸性溶液中では正の電荷を持ち、塩基性溶液中では負の電荷を持つ－＋ NH3 ＋ NH3 pH＜pI COO NH２ COO－ COOH NH3＋－ COO COOH NH3＋ pH＝pI COO－ NH２ pH＞pI 等電点では純電荷がゼロになる（＝電場の力を受けなくなる）ため、タンパク質の分子はその位置に留まる等電点電気泳動のイメージ Before ＋ 8.8 3.9 7.1 7.1 8.8 8.4 7.1 3.9 3.7 5.3 3.7 5.3 － After ＋ 3.7 3.9 3.7 3.9 ｐHが低い 7.1 7.1 7.1 5.3 5.3 ｐH勾配 8.4 8.8 8.8 ｐHが高い－キャリアアンフォライトを用いたpH勾配ポリアクリルアミドゲルにさまざまな等電点を持つキャリアアンフォライト（両性担体）混合物を加え電圧をかける・製品のロット差が大きい・pH勾配が不安定・チューブ状ゲルは壊れやすい固定化pH勾配（IPG法： Immobilized pH gradient）ポリアクリルアミドゲル作製時に酸性や塩基性の種々のアクリルアミド誘導体（Immobiline)を添加しpH勾配をゲルに共有結合させる・ｐH勾配が固定化されているため正確で安定している・酸性度・塩基性度が高いタンパク質も分離できる・ゲルの取り扱いが簡単 Immobilineゲルの構造（R＝弱酸性あるいは弱塩基性緩衝基）再現性が高い２D-PAGEが可能になった各種サケ科の泳動パターン PhastGel IEF 5-8使用 CBB染色 lane 1,2：Atlantic salmon lane 3,4：Pink salmon lane 5,6：Chum salmon lane 7,8：Rainbow trout