Title 既存薬剤からの新規抗インフルエンザウイルス化合物の探索( 内容と審査の要旨(Summary) ) Author(s) 福岡, 万佑子 Report No.(Doctoral Degree) 博士(医科学) 連創博甲第13号 Issue Date 2012-03-25 Type 博士論文 Version none URL http://repository.lib.gifu-u.ac.jp/handle/123456789/42972 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏名(本籍) 学位の種類学位授与番号学位授与専日付攻学位論文題目万福岡佑博士(医科学) 甲第 13 号平成 24 年子(愛知県) 月 3 日 25 医療情報学専攻既存薬剤からの新規抗インフルエンザウイルス化合物の探索 (StruCture･based discovery of anti･influenza virus among compounds medicines) 学位論文審査委員深尾 (副査)教授山本 (副査)教授木内敏眞一 (主査)教授幸由美書 (副査)教授桑田一論文内容の要旨【背景】 A型インフルエンザウイルス(InfluenzaAvirus;IAV)感染症は､世界で関心を集めているウイルスの一つである｡IAVは変異が早く､薬剤耐性株が出現しやすい｡現在､治療薬としてノイラミニダーゼ阻害薬であるオセルタミビルやザナミビルが使用され､高い効果をあげているが､これらの薬剤にも既に耐性株が出始めている｡これが大流行すれば人類のみならず動物達にとっても大変な脅威となる｡耐性株が流行した場合に備え､代替薬となり得る薬剤､特にこれまでと作用機序の異なる新薬を確保しておくことは喫緊の課題である｡実はこのような新規抗IAV薬は､この数年で既に何個か報告されている｡しかしながら一般的に､新規化合物が薬として認証されるまでには長い時間がかかる｡本研究では､新しい作用機序の薬を発見する､早期の実用化を目指すという課題を同時に解決するため､既に他の病気の治療薬として使用されている化合物の中から従来とは異なるメカニズムで作用する抗ウイルス化合物の探索を行った｡【結果】 Insilicoscreening:既存薬剤の中から抗IAV効果のある化合物を探索するために､ICMと既存薬剤のデータベースを用いたドッキングシミュレーションを行った｡IAVのRNAポリメラーゼはPA､ PBl､PB2から成る三量体である｡アミノ酸配列は株間でよく保存されており､ウイルス蛋白質の中でも変異が起こりにくいと予想される｡またRNA依存性RNApolymeraseはヒトにはない蛋白質であることから､薬剤の副作用も比較的少ないと考えられる｡そこでPAとPBlの結合部位を標的として､既存薬剤のデータベースとのドッキングシミュレーションを行った｡この後の細胞試験でウイルス増殖抑制効果の認められた3種の化合物(benzbromarone､diclazuril､trenboloneacetate)の自由エネルギーに基づく結合スコアは､それぞれ-25.46､･25.93､･26.12kcal/molであった｡ Exvivoscreening:ドッキングシミュレーションの結合エネルギーと結合部位に基づいて40個の化合物を選出し､細胞試験を行った｡化合物の抗IAV効果を調べるために､IAV八軒SN/33(HINl)株とMDCK細胞を用いてプラークアッセイを行った｡細胞試験の結果benzbromarone､diclazuril､ trenboloneacetateの3種類に抗ウイルス作用が認められ､EC50はそれぞれ39土1.7､31土5.3､およ一17- 夫び51土2.8pMであった｡ Bindingassay:PAサブユニットと化合物との結合性を調べるために､表面プラズモン共鳴(SPR) とウイルスのRNAポリメラーゼの転写活性測定を行った｡SPRでは､大腸菌で発現し精製したPAの C末端をセンサーチップに固定し､80pMから2倍段階希釈した化合物を流して結合性を測定した｡リガンドとレセプターの結合比を1:1と仮定し解離定数(KD)を算出したところ､benzbromaroneはKD =48.2pM､diclazurilは211pM､trenboloneacetateは91pMとなった｡SPR反応はbenzbromarone では高濃度で飽和し､PAと特異的に結合していることが示された｡一方diclazurilでは濃度に比例してSPR反応が大きくなり､mに対して非特異的な吸着が認められた｡PAとtrenboloneとの結合性は非常に低かった｡転写活性は､293T細胞にウイルスRNAポリメラーゼ蛋白質発現プラスミドを導入したレプリコンアッセイにより測定した｡化合物を5､15､50pMの濃度で加えたところ､benzbromaroneとdiclazuril では転写活性が低下したが､trenboloneacetateでは活性への影響は認められず､SPRに一敦した結果となった｡本研究により､IAVポリメラーゼを標的とした抗IAV化合物として､benzbromaroneとdiclazuril を発見した｡benzbromaroneとdiclazurilは薬剤として既に使用されており､invivoでの毒性や代謝もよく研究されている｡さらに､これらの化合物は従来のインフルエンザ治療薬とは作用メカニズムが異なるため､現在の治療薬に耐性を持つ新型IAVにも抗ウイルス作用があると考えられる｡治療薬耐性ウイルスが大流行を起こした場合に､代替薬として使用できる可能性が期待できる｡論文審査結果の要旨本論文は､世界で関心を集めているA型インフルエンザウイルス(InfluenzaAvirus;IAV)に対する抗ウイルス化合物の探索を行った成績をまとめたものである｡現在､IAV感染症治療薬としてノイラミニダーゼ阻害薬であるオセルタミビルやザナミビルが使用され､効果をあげているが､これらの薬剤には既に耐性株が出始めている｡耐性株が流行した場合に備え､これまでと作用機序の異なる新薬を確保しておくことは喫緊の課題である｡しかし同時に早期の実用化を目指すという課題もあるため､本研究では､既に他の病気の治療薬として使用されている化合物の中から従来とは異なるメカニズムで作用する抗ウイルス化合物の探索を行った｡ウイルス RNAポリメラーゼのサブユニットであるPAとPBlの相互作用部位に結合する化合物を､既存薬剤のデータベースを用いたドッキングシミュレーションにより探索し､結合エネルギーと結合部位に基づいて40個の化合物を選出し､IAV/WSN/33(HINl)株とMDCK細胞を用いてプラークアッセイを行った｡その結果benzbromarone､diclazuril､trenboloneacetateに抗ウイルス作用が認められた｡ PAを用いた表面プラズモン共鳴(SPR)実験では､benzbromaroneでは高濃度で飽和し､PAと特異的に結合していることが示された｡RNAポリメラーゼ転写活性は､benzbromaroneとdiclazurilでは低下したが､trenboloneacetateでは影響は認められなかった｡ Benzbromaroneとdiclazurilは薬剤として既に使用されており､invivoでの毒性や代謝もよく研究されている｡さらに､これらの化合物は従来のインフルエンザ治療薬とは作用メカニズムが異なるため､現在の治療薬に耐性を持つ新型IAVにも抗ウイルス作用があると考えられる｡これらの知見 -18- は､IAV感染症に対する論理的創薬法の有効性､及び新たなメカニズムを有する代替薬が既存薬の中に存在する可能性を示したものであり､今後の治療薬開発戦略に有用な示唆を与えるものであり､博士論文として価値あるものと判断した｡最終試験結果の要旨福岡氏の学位論文の主要部分は審査付き学術雑誌に公表済みの1編の論文に基づくものであり､本論文が学位論文として完成された内容を有する事を確認した｡また､公聴会において､学位論文の内容に関する事項､すなわち､インフルエンザウイルスの生物学的特徴､/n si//co docking simulation､eX V/vo screening､binding assay､RNA転写活性などに関して諮問を行った｡申請者から十分な内容の回答が得られたので､最終試験に合格したと判定した｡論文 Mavuko Fukuoka,Moeko Minakuchi,AtsushiKawaguchi,Eyosuke KazuoKuwata,StruCture･baseddiscoveryofanti･influenzaviruSAcompounds BiochimBiophysActa.1820,90･95,2012(I.F.:4.663) -19･ Nagata,YhjiO.Kamatari, amongmedicines.