V29−23 ウシの卵子や胚の水透過性と耐凍剤透過性 V29−24 超急速ガラス化保存したウシ体外胚のストロー内一段階希釈法の検討 ○原隆夫1・河合泰典1・日浦千尋2・山崎慎一郎2・市川恭子2・恒石望太郎2・葛西孫三郎1・枝重圭祐1 ○詫摩哲也1・笠正二郎2・内山保彦3・坂元克弥4・西木秀人5・福原順子6・佐々木恵美7・福見善之8・井上哲朗9・中西一誠10・今井敬11 1高知大農・2高知県畜試 medacalp＠hotmaiLco．jp 【目的】ウシでは、卵子や初期分割胚の耐凍性は低く、後期桑実期以降の胚では高い。細胞膜透過性は細胞の耐凍性に大きな影響を与える。マウス胚では桑実期以降に水や耐凍剤に対する透過性が著しく上昇することが示されているが、ウシ胚における詳細は知られていない。そこで本研究では、成熟卵子と胚の水や耐凍剤に対する透過性がどのように変化するかを調べ、さらに水や耐凍剤がどうのような経路で透過しているか推定した。【方法】成熟卵子と各ステージの胚を、等張のPBl液から25℃の高張なシュクロース添加PB1液あるいはグリセロール（Gly）、エチレングリコール（EG）、DMSOあるいはプロピレングリコール（PG）添加PBl液（8−10％）に浸して体積変化を調べ、その体積変化から水透過係数および耐凍剤透過係数を算出した。そして、温度依存性を示すArrhenius活性化エネルギー（Ea）を算出した。【結果】水、GlyおよびEGに対する透過性は桑実期以降の胚で高くなった。また、これらの透過性に対するEaは桑実期以降で低かったことから、これらは主に促進拡散によって透過していることが示唆された。一方、 DMSOとPGに対する透過性はステージによる差は小さく、これらの透過性に対するEaは高かったことから、これらは主に単純拡散によって透過していることが示唆された。 V29−25 MMV法によりガラス化したブタ胚の外科的お 1佐賀畜試・2福岡農総試・3新潟畜研・4干葉畜総セ・5東京農総セ・6和歌山畜試・7島根畜技セ・8徳島畜研・9長崎畜試・10鹿児島肉改研・11家畜改良セ ybbtkmtty＠yahoo．cojp 【目的】第104回本学会で笠らが報告した超急速ガラス化保存胚のストロー内一段階希釈法と既存の緩慢凍結法との比較試験を行った。【方法】受精7∼8日目の体外胚を供した。20％GL＋20％ EGを基礎ガラス化液とした区（2020区）および10％GL＋ 30％EGを基礎ガラス化液とした区（！030区）では、胚を微少量のガラス化液と共に用具に乗せ、直ちに超急速ガラス化し予め希釈液を充填したストロー内で保存した。一段階希釈はストローを微温湯に投入し用具を希釈液内に誘導して行った。対照として10％EGを含む液に胚を移し緩慢凍結した区（10ESB区）を設定し、融解はストローを微温湯に投入して行った。加温希釈後、胚を72時問培養し生存率（SR）および透明帯脱出率（HR）を調査した。なお発生培養条件の違いにより共培養胚と非共培養胚を分けて検討した。【成績】共培養胚でのSRは！0ESB区に比べ2020区および 1030区で有意に向上し（55％vs87％，83％）、HRも同様であった（32％vs67％，58％）。一方非共培養胚ではSRに有意差は認められなかったが、HRは10ESB区に比べ2020区で有意に向上した（51％vs71％）。 V29−26 ブタ卵巣皮質組織片超低温保存法の開発よび非外科的移植による生存性 ○藤野幸宏㌧中村嘉之1・小林博史1・中野貞夫2・鈴木干恵3・吉岡耕治3 ○鈴鴨知佳π・佐野大介1・杉尾周平1・中嶋紀覚㌧仲田誠1・猪股智夫㌧久慈直昭2・吉村泰典2・柏崎直巳1 1埼農総研・2富士平工（株）・3生物研 1麻布大院獣医・2慶応大医 aO166435＠pref．saitama．1g．jp maO609＠azabu−u．ac．lp 【目的】Metal mesh vitri価ation（MMV）法でガラス化したブタ拡張胚盤胞を、外科的または非外科的に雌ブタに移植し受胎率および胚の生存率を比較検討した。【方法】ホルモン処置後7日目に回収した拡張胚盤胞を7．5％エチレ【目的】哺乳類卵巣組織の超低温保存法の開発を目的として、緩慢凍結法およびガラス化法によりブタ卵巣組織片を超低温保存し、保存後の組織片を組織学的に検討した。【方法】と畜場で得た未経産ブタ卵巣から皮質を切り出して1．5mm角に細切し、細切した組織片を超低温保存した。ングリコール（EG）＋7．5％DMSO＋20％FBS加PBSに5 分問平衡し、15％EG＋15％DMSO＋0．6Mトレハロース緩慢凍結法では、室温から1℃までを7．0℃／min、1℃から一（Tr）に移した後、ステンレス製の網に付着させて液体窒 30℃までを0．3℃／minで冷却し、L5Mの凍害保護物質、素中（LN）に投入しガラス化した。LN中から金網を 0．5MTr＋20％FBS加PBS中に投入して胚の融解および耐凍剤の希釈を行い、10％FBS加NCSU37に移した。この胚 DMSO、PROH、EGを比較した。また、ガラス化法ではを外科的に、子宮角の先端もしくは分岐部より15cmに移植した。非外科的には、ポリスチレン製のカテーテルを用いて子宮角内に移植した。【結論】ガラス化胚20個ずつを外科的に未経産ブタに移植した結果、移植部位に関わらず 80％の受胎率（8／10vs4／5）が得られ、胚の生存率はそれぞれ18．5％、2LO％を示した。非外科的移植は10頭の経産クライオトップを用いた方法（Kuwayama，2000）とクライオチューブを用いた方法（Migishima，2003）を比較した。融解・加温後の組織片から組織標本を作製し、HE染色によって組織学的に評価した。【結果】超低温保存後の卵巣組織片は、すべての試験区において組織学的に正常な形態を示していた。今後は保存後の組織片を免疫不全マウスヘ異種移植し、原始卵胞内卵母細胞の成熟能を検討していく予定である。ブタに行い、3頭が受胎し2頭の雌ブタが6頭と3頭の子豚を分娩した。本実験の結果、ガラス化したブタ胚の非外科的移植により産子を得ることができたが、MMV法でガラス化したブタ胚の非外科的移植の成功には、外科的移植よりも多くの要因が関与することから、さらなる検討が必要である。一81一