Code: PPARA-CBP STORAGE : Store at 2 - 8 ℃ EXPIRY : The expiry date is stated on the package and will be at least 4 weeks from the date of dispatch. Warning For research use only. Not recommended or intended for diagnosis of disease in humans or animals. Do not use internally or externally in humans or animals. 製品の仕様はやむを得ず変更される場合がありますので、あらかじめご了承ください。 PPARA-CBP Ver.2-1J 目次ページ１. はじめに ............................................................................................................................ 1 ２. キットの特長 ...................................................................................................................... 1 ３. 測定原理 ........................................................................................................................... 1 ４. アッセイシステムの内容 ..................................................................................................... 3 ５. キット使用上の注意 ............................................................................................................. 3 ６. アッセイ方法 ...................................................................................................................... 5 ７. ８. (1) 必要な器具および試薬 .............................................................................................. 5 (2) 溶液の調製............................................................................................................... 5 (3) コアクチベーター固相化プレートの準備...................................................................... 6 (4) Blank、ポジティブ・コントロールの準備...................................................................... 6 (5) サンプル溶液の準備 ................................................................................................. 7 (6) 測定操作手順 ........................................................................................................... 7 測定値の解析.................................................................................................................. 10 (1) 検体の偽陽性/真陽性の判別 .................................................................................. 10 (2) アッセイ結果の正確性 ............................................................................................. 11 (3) リガンド測定例 ........................................................................................................ 11 トラブルシューティングガイド............................................................................................. 12 (1) 吸光度が低すぎる ................................................................................................... 12 (2) 吸光度が高すぎる/zero standard 値が高すぎる ..................................................... 12 (3) 測定の精度、再現性が良くない ............................................................................... 12 PPARA-CBP Ver.2-1J １. はじめに Peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR） alpha は肝臓、骨格筋に主に発現し、脂質代謝調製に重要な役割を果たしています。また、血中中性脂肪低下、HDL コレステロール増加作用のあるフィブラート系薬の分子標的であることが知られています。 PPARαなど核内レセプターが生体内で遺伝子発現を調節するためには、レセプターにリガンドが結合するだけではなく、コアクチベーターなどコファクターと称されるタンパク質が関与していることが、近年の研究で明らかになりつつあります。本キットは、レセプターにリガンドが結合し複合体を形成した後、さらにコアクチベーターが選択的にリクルートされる点に着目した「コアクチベーター法」を用いています。これにより、PPARαに結合するリガンドにおけるコファクター特異的な作用予測を可能にする in vitro 測定系です。２. キットの特長 z 全行程で、操作時間は約 4 時間で終了します。 z 操作方法は抗体を用いた ELISA 法と同様で簡便です。 z 放射性物質、蛍光物質を利用していないため、特殊な装置や設備は不要です。 z 96 穴マイクロタイタープレートを利用しているため、多数のサンプルの同時測定が可能です。 z 測定に必要な試薬類はすべてキットに含まれています。３. 測定原理 EnBio RCAS for PPARαは、プレート上に固相化したコアクチベーターを介して、リガンドとレセプターの複合体を特異的に結合させることによりリガンドを定量的に測定するアッセイキットです。コアクチベーター(CBP)の LXXLL モティーフを含むリコンビナント・タンパク質を固相化したプレート内で組換え hPPARαと試験サンプルを室温で 1 時間反応させます。プレートを洗浄後、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識した抗レセプター抗体をプレートに加え、30 分間室温反応させます。プレート洗浄後、最後に HRP の基質であるテトラメチルベンジジン（TMB）を加え酵素反応を行ない、反応液の吸光度を 450 nm で測定することにより、サンプルのリガンド作用を定量的に測定することが出来ます。リガンドがアゴニストである場合、レセプターと結合してレセプターのコンフォメーションチェンジを引き起こすことにより、プレートに固相化したコアクチベーターと結合します。したがって、アゴニストでは吸光度はリガンド用量依存的に上昇します。 PPARA-CBP Ver.2-1J 1/12 コアクチベーターリガンド核内レセプター（NR）組換え体プレートの準備 HRP標識抗NR抗体１次反応 TMB(発色基質) 発色２次反応発色・検出 PPARA-CBP Ver.2-1J 2/12 ４. アッセイシステムの内容本キットには、以下に示すものが含まれています。各試薬の調製法については“溶液の調製” の項を参照してください。 CONTENTS No 1 Content Microtiter plate ＊分割利用は出来ません 2 Recombinant coactivator (CBP) 3 Recombinant hPPARα (LBD) 4 Anti-PPAR/HRP antibody, 100x 5 Assay buffer 6 Wash buffer concentrate, 10x 7 TMB substrate 8 Stop solution 9 Blank: Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 10 11 WY14643 (WY) standard: 5.0 mM dissolved in DMSO Plate sealer Amount 1 plate 2 vial (lyophilized in 10 mL-glass tube) 2 vial (lyophilized in 10 mL-glass tube) 1 vial (0.14 mL in 1.6 mL - plastic tube) 1vial (30 mL in 30 mL - PP bottle) 1vial (50 mL in 60 mL – PP bottle) 1 vial 1 vial (14 mL in 30 mL - PP bottle) 1 vial (4 mL in 5 mL - glass tube) 1 vial (0.5 mL in 1.6 mL - glass tube) 1 sheets ５. キット使用上の注意・本製品は、試験研究用に製造されたものです。人、動物の診断目的での使用は絶対にしないでください。また、人体への投与は絶対にしないでください。・危険を伴う場合がありますので、試薬について基本的な知識のある方以外は使用しないでください。・実験中は適切な保護服を常に着用し、試薬が皮膚や目等に直接触れたり、体内に入ることのないよう注意深く取り扱ってください。万一、そのようなことが起きた場合には直ちに大量の水で洗浄するなどし、医師の指示を受けてください。・使用する前にラベル表示(品名)を確認してください。・全ての試薬は室温に戻してからご使用ください。特に、TMB substrateは必ず室温に戻してから使用してください。またWash buffer concentrate, 10x （10 倍濃縮洗浄原液）は低温で PPARA-CBP Ver.2-1J 3/12 析出していることがあります。室温に戻した後、インバージョン(転倒混和)により十分に再溶解してからご使用ください。・試薬取り扱いの際は、新しいチップ・ピペット等を利用してください。・サンプル、試薬類は分注する前によく撹拌してください。撹拌はピペッティングまたはインバージョンにより行い、ボルテックスミキサーなどによる激しい攪拌は避けてください。特に組換え受容体は不安定な試薬のため、溶解、サンプルとの混合はピペッティングなど穏やかな撹拌条件で行ってください。・プレートの底面を汚さないようにしてください。底面が汚れていると吸光度測定が正確に行われません。データのバラツキの原因になります。・スタンダードおよびサンプルは 2 重以上の測定を推奨いたします。・試薬類のプレートへの分注は、分注時間にタイムラグが生じないように、ストップウォッチなどを使い、一定の間隔で実施するようにしてください。・異なるキット・ロット間での試薬の使い回しはしないでください。・洗浄操作は特に重要ですので、必ず各ステップで完全に、かつ各ウェルとも同じ様に洗浄してください。洗浄後は、プレートが乾燥しないよう、迅速に次のステップに進んでください。・試薬を加える順番、インキュベーション時間は方法の欄に書かれている内容に従ってください。 PPARA-CBP Ver.2-1J 4/12 ６. アッセイ方法アッセイを始める前に必ずお読みください。試験する検体の性質によっては、検体の高濃度領域において偽陽性が出ることがあります。結果が偽陽性であるか真陽性であるかの判定方法に関しては、７．測定値の解析（9 頁）をご参照ください。 (1) 必要な器具および試薬・マイクロピペットおよびチップ (1-20 μL, 20-200 μL and 100-1,000 μL) ・ディスポーザブルガラス製テストチューブ（サンプル調製用および保存用）・ポリプロピレン製チューブ (抗体溶液調製用) ・メスシリンダー (500ml) ・蒸留水あるいは脱イオン水・ DMSO (サンプル調製用としてキットに添付してありますが、足りない場合は市販の特級試薬を使用してください。) ・マイクロプレート用振とう器（プレートシェーカー）・ 450nm で測定可能なマイクロプレート用吸光光度度計・ 8 連マイクロピペット (200μl) ・アイスボックス（調製後の PPARα溶液や HRP-抗体溶液の一時的保管のために使用します。）・ストップウォッチ (2) 溶液の調製 ① Wash buffer Wash buffer concentrate(10 倍濃縮洗浄原液, 50ml)全量をメスシリンダーに移し、蒸留水あるいは脱イオン水を加えて最終容量を 500ml に調製し、泡立てないように注意しながら、よく混和してください。調製後 2～8℃で保存し、30 日以内にご使用ください。 ② Coactivator solution Recombinat coactivator (CBP) 1 本あたり 6 mL の Assay buffer を加えた後、インバージョンにより穏やかに混合します。ボルテックスミキサーなどによる激しい撹拌は行わないでください。プレート 1 枚の作製に CBP 2 本 (12 mL) の Coactivator solution が必要です。 PPARA-CBP Ver.2-1J 5/12 ③ Recombinant PPARα solution ボトルあたり 6 mL の Assay buffer を加えた後、インバージョンにより穏やかに混合します。ボルテックスミキサーなどによる激しい撹拌は決して行わないでください。使用するまで PPARα溶液はアイスボックス等で冷やしておいてください。一度溶解した PPARα溶液は再利用できません。溶解したその日の内にアッセイに使用するようにしてください。 ④ Anti-PPAR/HRP solution 室温に戻した後、ピペッティングにより anti-PPAR/HRP antibody, 100x を穏やかに混合します。次に洗浄液にて 100 倍希釈して使用します。＊ 1 ウェル分(100μL/well)の anti-PPAR/HRP working solution 混合液を調製する場合、ピペッティングによる損失容量を考慮して、 Anti-PPAR/HRP solution: Wash buffer= 1.2 μL: 118.8 μL, を調製します。 (3) コアクチベーター固相化プレートの準備 a. すべてのウェルに 8 連マイクロタイターピペットを用いて、200-300 μL ずつ洗浄液を満たします。次にデカンテーションにより全てのウェル中の溶液を除いた後、紙タオル等におしつけて残っている液を完全に取り除きます。この操作を 3 回繰り返してください(Wash buffer の調製法は前項を参照してください)。 b. 各ウェルに 100 μL の調製した coactivator solution を加えます。 c. プレートをplate sealerで密閉し、プレートシェーカーを用いて振とうしながら室温(20～28℃) で 1 時間反応させます 1 。（＊この反応の間にその他の試薬とサンプルの調製を行います。） d. 2 時間反応後、ステップ２と同様の方法で再び洗浄液にてプレートを洗浄し、試験に供します。 (4) Blank、ポジティブ・コントロールの準備 2 Blank（DMSO）とポジティブコントロール（WY 5mM)は室温にて溶解させた後、ピペッティングにより穏やかに混合します。残りの Blank と WY standard は再び４℃で保存してください。 1 振とうはサンプル溶液がシールにつかない程度の回転数で振とうしてください。 2 WY standardの希釈系列を調整する場合はBlank (DMSO)で希釈してください。 PPARA-CBP Ver.2-1J 6/12 (5) サンプル溶液の準備 Blank（DMSO）にて調製してください。調製はガラス試験管やサンプル調製用プレート等を用い 3 て行なってください。 a. サンプルを DMSO に溶解して調製します。（水溶性のサンプルの場合、Assay buffer にサンプルを溶解して使用することも可能です。） b. 反応プレートウェル中で PPARα溶液とサンプル溶液は 95:5 の割合で混合します。 (6) 測定操作手順 TMB について・・・・TMB はそのまま使用します。使用前にかならず室温に戻してください。残りの TMB 溶液を保存する場合は 2-8℃にて行ってください。TMB の分注には必ず新品のピペットチップなどを使用してください。分注作業などで実験器具の汚れなどから不純物が混入したり、古くなった TMB は分解し薄青色に変化しています。そのような TMB は使用しないでください。 STEP 1: Sample-PPARα Reaction a. コアクチベーター固相化プレートに 95 μL/well の PPARα溶液を添加します。次にサンプルを 5 μL /well で添加します。アッセイ試験毎に Blank(DMSO)と WY(5 mM)を加えたネガティブ、ポジティブコントロールのウェルも準備します。 b. プレートを plate sealer で密閉し、プレートシェーカーを用いてサンプル溶液がシールにつかない程度に強く振とうしながら、室温（20～28℃）で 1 時間反応させます。 STEP 2: anti-PPAR/HRP antibody Reaction a. STEP1 反応終了後、プレートを Wash buffer で 3 回洗浄します。洗浄方法は“コアクチベーター固相化プレートの準備”の項を参照してください。 b. 調製した anti-PPAR/HRP 抗体溶液を 100 μL/well ずつ加えます。 c. プレートを plate sealer で密閉し、プレートシェーカーを用いてサンプル溶液がシールにつかない程度に緩やかに振とうしながら室温(20～28℃)で 30 分間反応させます。 STEP 3: Detection a. STEP2 反応終了後、プレートを洗浄液で 3 回洗浄します。洗浄方法は“コアクチベーター固相化プレートの準備”の項を参照してください。 b. 各ウェルに TMB 基質を 100 μL /well ずつ加えます。 3 プラスティック製試験管類はプラスティックからの溶出成分の影響やサンプル化学物質が吸着する可能性があり、正確な結果を得ることが出来ない可能性があります。プレートの材質などがアッセイに影響を与えないことを予め確認した上でお使いください。 PPARA-CBP Ver.2-1J 7/12 c. 室温で静置し、発色度合い（青色に変化します）を確認しながら、10 分から最大 20 分間反応させます 4 。反応中は振とうをしないでください。 d. 発色反応後、反応停止液( Stop solution) 100 μL/well を加えます（黄色に変化します）。 e. 30 分以内に 450nm の吸光度を測定します。 4 発色反応は室温などの条件の影響を受けることがあります。発色反応が遅い場合は反応時間を長くすることにより補正してください。その際、反応時間は 20 分間を上限としてください。長時間の発色反応はブランク(DMSO)の発色も上昇させるので注意してください。 PPARA-CBP Ver.2-1J 8/12 ＜測定手順＞プレート洗浄【3 回】 Recombinant coactivator（CBP）: 100µL 反応【室温、2 時間】プレート洗浄【3 回】 Recombinant hPPARα: 95µL 検体（DMSO 溶液）: 5µL 反応【室温、1 時間】プレート洗浄【3 回】 Anti-PPAR/HRP antibody: 100µL 反応【室温、30 分】プレート洗浄【3 回】 TMB: 100µL 発色【室温、20 分】 Stop solution: 100µL 測定（450 nm） PPARA-CBP Ver.2-1J 9/12 ７. 測定値の解析 (1) 検体の偽陽性/真陽性の判別試験する検体の性質によっては、特に高濃度領域において、受容体がコファクターを介さず非特異的にプレートに吸着するような現象が生じる場合があります。この現象（偽陽性）とコファクターを介した結合（真陽性）とを区別するには、プレートにコファクターを結合させない状態で試験を行い、コファクターを結合させた通常の試験との反応性の差を確認することを推奨します。試験方法は以下の通りです。 a. 通常の Coactivator solution（Recombinant coactivator の希釈液）の代わりに、 Assay buffer を各ウェルに添加し、コアクチベーター非固相化プレート（以下、CBP （－））の準備を行ないます（6 頁参照）。 b. 上記 CBP（－）のプレートを用いて、測定操作手順（7 頁参照）に従って、測定を行ないます。通常のコアクチベーター固相化プレート（以下、CBP（＋））を用いた試験に関しても、測定操作手順（7 頁参照）に従って測定を行ないます。 c. CBP（＋）、CBP（－）のプレート共に、ネガティブ、ポジティブコントロールとして、それぞれ Blank（DMSO）、WY 標準（5.0 mM、Final 250µM）のデータを取得します。 d. 被検体における CBP（＋）、CBP（－）の吸光度差をネガティブコントロールと比較して検体の陽性/陰性の判断を行ないます。図 1 に CBP（＋）および CBP（－）を用いて取得したデータ例を示します。図 1 左は各サンプルにおける CBP(＋)および CBP（－）の吸光度を、図 1 右は各サンプルにおいて、CBP（＋）の吸光度から CBP（－）の吸光度を差し引いた値を示しています。ここでは、サンプル A、B ともに、CBP （＋）の吸光度は同程度でしたが、CBP（－）での応答値との比較により、サンプル A よりもサンプ Sample B Sample A 0.0 Wy(250µM) 0.5 Blank(DMSO) OD450 [CBP(+)-CBP(-)] Sample B Sample A 1.0 図1 PPARA-CBP Ver.2-1J 1.5 CBP（－） CBP（＋） Wy(250µM) 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Blank(DMSO) OD450 ル B の方が高い活性を有していることが確認されました。 CBP（＋）および CBP（－）を用いたデータ例 10/12 (2) アッセイ結果の正確性 Blank (DMSO)と WY (5.0mM; final concentration is 250 μM)の吸光度の差が 0.6 以下である場合、サンプルのアッセイ値が正確に測定できていない可能性があります。“トラブルシューティングガイド”の項を参照し、正確なアッセイ値を得るために再試験を行ってください。 (3) リガンド測定例本キットで測定した結果の例を図 2 に示します。 2.0 1.8 1.6 OD 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.0001 0.01 1 100 10000 Conc (uM) Wy 14643 (EC50=3.0µM) GW7647 (EC50=9.2nM) 図 2 用量応答曲線例 PPARA-CBP Ver.2-1J 11/12 ８. トラブルシューティングガイド (1) 吸光度が低すぎる 1.1) 1.2) 1.3) 1.4) 1.5) 1.6) 吸光光度計の測定波長が 450 nm になっていることを確認してください。インキュベーション時間と温度を確認してください。使用前に試薬が室温に戻っていることを確認してください。試薬の調製法を確認してください。 TMB 添加後の発色時間は 10 分以上、20 分以内としてください。反応停止液を加えた後、30 分以内に吸光度を測定してください。 (2) 吸光度が高すぎる/zero standard 値が高すぎる 2.1) 2.2) 2.3) 2.4) 2.5) 2.6) PPARα溶液の調製、サンプル／PPARα溶液の混合などはピペッティングやインバージョンなど穏やかな条件で行ってください（ボルテックスミキサーの使用を避けてください。）洗浄の各ステップでウェルが洗浄液で満たされた後、完全に除かれていることを確認してください。洗浄操作後プレートを紙タオルに打ちつける等して洗浄液が完全に除かれていることを確認してください。インキュベーション時間と温度を確認してください。試薬の調製法を確認してください。 TMB 添加後の発色時間は 10 分以上、20 分以内としてください。 TMB が劣化して青味がかっている場合は使用しないでください。 (3) 測定の精度、再現性が良くない 3.1） 3.2） 3.3） 3.4） 3.5）マイクロピペットの容量がきちんと補正されていることを確認してください。標準溶液の調製法を確認してください。マルチチャンネルピペットをご使用の際は試薬毎にチップおよび分注用容器をかえ、各溶液が混ざらないようにしてください。洗浄が十分であるか確認してください。 TMB が劣化して青味がかっている場合は使用しないでください。 Manifactured by EnBioTec Laboratories Co., Ltd. Chiyoda-Parion Bldg., 6th floor, 2-3-16 Kandasuda-chou, Chiyoda-ku, Tokyo 101-0041, Japan PPARA-CBP Ver.2-1J 12/12 Quick Guide STEP 1: Plate preparation 1. Pre-wash your plate with 3 x 200-300 μL/well wash buffer. 2. Add x100 Coactivator solution diluted with wash buffer to the each well (100 μL/well). 3. Incubate the plate with gentle agitation for 2 hr at room temperature. 4. (During the plate incubation), prepare sample diluent and PPARα solution. STEP 2: First Reaction (Ligand-Receptor-Coactivator Complex) (After washing the plate with 3 x 200-300 μL/well of wash buffer) 1. Direct addition to the plate of 95 μL of PPARα, followed by 5 μL of ligand (WY standard) or agonist. 2. Incubate the plate with gentle agitation for 1 hr at room temperature. STEP 3: Second Reaction (HRP/Antibody-Receptor binding) 1. (After washing the plate with 3 x 200-300 μL/well of wash buffer), apply 100 μL of anti-PPAR/HRP antibody solution (100-fold dilution with wash buffer) to the wells. 2. Incubate the plate with gentle agitation for 30 min at room temperature. STEP 4: Detection 1. (After washing the plate with 3 x 200-300 μL/well of wash buffer), add 100 μL of TMB substrate to all wells. 2. Incubate at room temperature for 20 min (no shaking!). 3. Add 100 μL of Stop solution to all wells. 4. Read the optical density at 450 nm. 5. Calculate the results. PPARA-CBP Ver.2-1J