配偶子の超低温保存超低温保存の意義超低温保存の意義卵子初期胚 • • • • • • 遺伝資源の保存（遺伝的な形質や特性変化の防止） • 感染、飼育管理上の事故の防止（疾病および遺伝的汚染の防止） • 飼育管理の省力化と経費節減 • 動物輸送の簡易化、長距離・国際間移動が容易 • 発情同期化が不要、余剰胚利用雌性遺伝子資源（ハプロイド）の保存感染、飼育管理上の事故の防止余剰卵子の保存放射線治療前などの妊孕性保存対策加齢による妊孕性低下への対策超低温保存の歴史 1949 Polge ニワトリ精子の凍結保存 1950～1970年代家畜の凍結精液開発、実用化 1972 Whittinghamらマウス胚の凍結保存に成功。 ①ジメチルスルホオキシド（DMSO）の利用 ②植氷処理による潜熱発生の防止 ③緩慢冷却による胚細胞内氷晶形成を防止 1985 Rall and Fahy マウス胚のガラス化凍結 1986～改良ガラス化保存法の開発ガラス化保存傷害凍結保存 1 ℃ 植氷共晶点冷却曲線（植氷あり）過冷却－4.5℃ 氷点－７℃ 潜熱の放出過冷却－4.5℃ 氷点 ℃ 冷却曲線（植氷なし）－0.5℃／分－25℃ 液体窒素へ固相 ◎適正な冷却速度 • 植氷による過冷却防止氷点－１℃ぐらいで過冷却を止める • 耐凍剤（凍害保護物質）の添加細胞内の蛋白と結合して水の移動を穏やかにし、塩害を防止 • 脱水氷晶を小さくする固相液相細胞内凍結を避ける方法液相固相固相液相液相 hr hr 緩慢凍結法 ① ステップワイズ法融解後、受精卵をいったんシャーレに取り出して段階的に耐凍剤の除去を行う。浸透圧変化の影響が少ないので受胎率は高いが、実験室での作業が必要。 ② ワンステップ法融解後、ストロー内で凍結液と希釈液を混合し、直接移植する。野外での作業が可能だが、希釈の待ち時間が必要。 ③ ダイレクト法融解後、耐凍剤の除去操作を行わず、直接移植する。野外で実用化されているが、受胎率が安定しない。等張液ガラス化法耐凍剤浸漬直後耐凍剤透過後植氷凍結操作長所 • 凍結時に氷の結晶による傷害を受けにくく、受胎率が高い。 • 凍結操作が短時間で完了する。 • プログラムフリーザーが不要短所 • 融解後、耐凍剤の除去が必要。 2 融解後の生存性に影響する要因 ◎細胞の要因 a. 細胞のサイズ b. 細胞膜の性質 c. 動物種 d. 胚の発育段階 e. 細胞質内の脂肪滴 f. 卵子や胚の質 g. 細胞骨格凍害 • • • • • • • 塩害最小容積外部からの機械的圧迫細胞膜・細胞内小器官の破壊低温傷害凍害保護物質の細胞毒性浸透圧ショック融解後の生存性に影響する要因 ◎手法の要因 a. 超低温保存法 b. 凍害保護物質 c. 凍害保護物質の平衡 d. 冷却速度 g. h. i. j. 凍害保護物質の希釈操作する環境温度融解もしくは加温の方法実施者 e. 液体窒素中への投入温度 f. 収容容器凍害保護物質 ① 低分子 ② 中性物質 ③ 低毒性 ④ 低温で水溶性が高い ⑤ 高濃度の濃縮が可能凍害保護物質（CPA)・耐凍剤細胞膜透過性ジメチルスルホオキシド（DMSO）エチレングリコール（EG)、グリセリンプロパンジオールなど細胞膜非透過性シュクロース、トレハロース、フィコールラフィノースなど 3 凍結胚の融解法融解目的 ① 凍害保護物質の除去 ② 復水手法ショ糖の添加脱グリセロールに伴う細胞の膨張が押さえられ、細胞の負担が減少する。空気中での保持融解時の氷の移動による悪影響を緩和する Vitrificationの実技絹谷産婦人科平岡原図 4