V29−15 ウシ胚伸張培養系における培養液の検討 V2946 マウス2−ce”bIock胚に対するアミノ酸添加効果 ○細江実佐1・牛澤浩一1・赤木悟史2・高橋透1 ○小池剛・早川晃司・米田明弘・渡辺智正 1生物研・2畜草研北大院農 hosoe＠affrc．go．jp ninzaburo＿59＿1121＠yahoo．co．jp 【目的】特定のマウス初期胚は体外培養すると2−cell biock 【目的】ウシ胚盤胞期までの培養系はこれまで詳細に検討されてきたが、透明帯から胚が脱出し、着床にいたるまでの期間の培養系の検討は少ない。当研究室ではウシ栄養膜の伸長過程を体外で再現し、伸長胚の遺伝子およびタンパク発現の変化を調べることを目的として、今回はウシ胚伸長培養系の改良を試みた。【方法】15℃で約24時問保存した卵巣由来の体外受精卵をIVD101（機能性ペプチド研）区、IVD101にday1（媒精日をdayOとする）あるいはday7にアミノ酸、クエン酸塩、イノシトールを添加した区（aaci day1区，aaci day7区）、胎膜細胞と共培養して得られたコンディションドメディウムをday7に半量添加した区（CM 区）の4区で培養した。いずれの培地にも、day7に27．7mM グルコースと10％血清を加えた。脱出胚盤胞は、dayllに直径1mmの穴をあけた2、4％アガロースゲルトンネルにいれて伸長培養を行った。【結果】胚盤胞の伸長率は、 IVDlO1区で2．9％、aaci dayl区で1L7％、aaci day7区で 13．3％、CM区で6．5％であり、有意な差はなかった。伸長胚の長さは、それぞれ最長6．2、8．0、11．3、15．4mmであった。 day11の胚の直径は、それぞれ315±134、416±152、 504±170・380±161μmであり、aaci day7区でIVD101区と比較して有意に胚が大きくなった（p＜0．05）。を起こすことが知られているが、その分子メカニズムは明らかにされていない。これまでに卵管上皮細胞との共培養で2−cell blockは解除されることが報告されている。たとえば、卵管内には多数のアミノ酸が存在していることから、胚発生にはこれらのアミノ酸が利用されていると考えられる。そこで、本研究ではアミノ酸の2−cell blockに及ぼす効果について調べることを目的とした。【方法】2−cell block を起こす系統にAKR／Nマウスを用いた。胚の体外培養は定法に従い、アミノ酸添加濃度は1mMに統一した。胚の体外発生の観察は、培養開始から24時問目、48時間目、72 時問目および120時間目に行なった。【結果】20種類のアミノ酸の効果を調べたところ、体外培養液にアスパラギン、グリシン、プロリン、アルギニン、およびシステインを添加すると、それぞれ61．9％、49．5％、42．8％、33．3％および 25．0％の割合で2−ceil blockが解除され、さらに胚盤胞まで発生することが観察された。しかし、それ以外の15種類のアミノ酸については2−cellblockを解除することはなかった。このことにより、体内環境下において正常な胚発生の進行にアミノ酸が利用されていることが示唆された。現在、ペプチドの2−cell blockに対する効果について検討している。 V2947 ブタICSI卵の体外培養におけるグルコース添加培地への移動時間の検討 V29−18 遠心および電気融合処理により作出したブタ第二減数分裂中期核置換卵の体外受精後の発生能 ○小南沙織・前泊直樹・鈴鴨知佳・中嶋紀覚・柏崎直巳 ○前泊直樹1・菊地和弘2・小沢学2・中井美智子2・野口純子2・金子浩之2・永井卓3・柏崎直巳1 麻布大獣医 1麻布大獣医・2農業生物資源研・3畜草研 aO3033＠azabu−u，ac，jp daO508＠azabu−u．ac．jp 【目的】ブタ卵細胞質内精子注入（ICSI）卵は体外発生が遅く、胚盤胞への発生率も低い。本研究は、ブタICSI卵の体外培養（IVC）におけるグルコース添加培地への移動時問がICSI卵の胚盤胞への発生に及ぼす影響を調べた。【方法】体外成熟卵に、凍結融解精子の頭部をICSIした。ICSI はピエゾマイクロマニピュレーターで行い、ICSI後1時間目に電気刺激により人為的に活性化誘起処理した。その後、 NCSU−37メディウムにて38．5℃、5％CO2in air湿度飽和の条件で培養した。電気刺激から48、53、58、および63時問後にグルコース添加培地にICSI卵を移し、ICSI6日後の胚盤胞への発生率および平均胚盤胞細胞数を調べた。1結果】胚盤胞への発生率は48、53、58、および63時間後で各々4．8％、2．1％、7．3％、47％で、また、平均胚盤胞細【目的】第二減数分裂中期（M−II期）核置換は発生能の低い卵胞数は各々29．0±3．g、38．5±3．5、30．1±7．3、3g．3±47であ母細胞の発生能の賦与に有効な技術である。本研究ではブタ体外成熟卵を用い、遠心および電気融合処理により作出したブタ核置換卵の体外受精（IVF）後の受精能および胚盤胞の発生能を評価した。【方法】体外成熟卵を用いて遠心処理および電気融合を行い、核置換卵を作出した（第99回日本繁殖生物学会）。また、透明帯を除去した体外成熟卵を対照区とした。核置換卵および対照区の成熟卵はブタ凍結融解精子にてIVFを行い、体外培養10時問および6日後に、受精能と胚盤胞への発生能を評価した。【結果】雄性前核形成率は、対照区と核置換区の聞に有意な差は認められなかった。胚盤胞への発生率は・対照区（26．3±9．0％）が、核置換区（4．4±1．9％）に比べて有意に高い値を示した（P＜ 0．05）。【結論】遠心および電気融合処理により作出したブった。これらの各試験区の間に有意な差は認められなかっタM−H期核置換卵はIVF後の受精能および胚盤胞への発生た（P＞0．05）。【結論】グルコース添加培地への移動時問は能を有することが示唆された。培養開始48から63時間の間では、ブタICSI卵の胚盤胞への発生能に影響を及ぼさないことが示された。一79一