北草研報 3 6:3 9-4 2( 2 0 0 2 ) ペレニアルライグラスの種子乾熱によるエンドファイトの殺菌佐藤尚親ホ・竹田芳彦 S t e r i 1i z a t i o no fendophytei np e r e n n i a lr y e g r a s s CLoliumperenneL . ) s e e dbyh e a tt r e a t m e n t Na r i c h i k aSA TO a ndYo s h i h i k oTAKEDA 本材料に求める育種現場では、海外や芝生用の材料、エコ Summary Thes t e r i l i z i n gmethodso fe n d o p h y t ei np e r e n n i a l タイプなどからエンドファイトが導入される場合があ r y e g r a s sC L o l i u mp e r e n n eL . )s e e dbyh e a tt r e a t m e n t りし w er ei n v e s t i g a t e d . が生じる九そこで、薬剤を使わず、エンドファイトが Thet r e a t m e n to fs e e d sa te i t h e r6 0and7 0C f o r1 0 0 d a y sd e c r e a s e dt h er a t eo fe n d o p h y t ei n f e c t e ds e e d l i n g s 、、エンドファイトの殺菌技術を確立する必要 7，8 1 1 ) 完全に殺菌され、簡易で発芽障害が極力小さい、種子の乾熱殺菌処理、法について検討した。 o n l yby2 9and44%，r e s p e c t i v e l y . Thee n d o p h y t ei n 0C f o r2 8dayswith s e e d swast o t a l l ys t e r i l i z e da t8 材料および方法 0 c o n c o m i t a n td e c r e a s ei ns e e dg e r m i n a t i o nby1 6%.The l i o c l a d i u ms p p . 材料として、菌糸に枝分かれの多い G h e a ts t e r i l i z e ds e e d sr e t a i n e dt h ev i a b i l i t yf o r2y e a r s かまたは、菌糸に枝分かれのない N eotyphodiuml o l i i . a t3Cand31%o fh u m i d i t y . のいずれかを保有している種子を供試した。即ち、 0 G l i o c l a d i u ms p p .保有種子は、 4倍体の天北農試育成の系統 A、系統 B及び系統 Cの 3系統の種子を供試した。キーワード:エンドファイト、種子乾熱処理、殺菌、ペ eotyphodiuml o l i i .保有種子は、 2倍体の「マまた、 N レニアノレライグラス Keywords:Endophyie，Heatt r e a t m e n to fs e e d si n 、i SR-4200J、「アドベント」及び「アンハッタン mJ d r y s t a t e， S t e r i l i z a t i o n， P e r e n n i a l クセント」の 4品種の種子を供試した。いずれの材料も、 R y e g r a s sC L o l i u mp e r e n n eL . ) 1 9 9 8 年に採種し、翌 1 9 9 9 年1 1月に乾熱処理を行った。 0 、処理として、各品種・系統種子を恒温乾燥機で、 6 緒 7 0 、及び8 0Cの 3水準で乾熱処理した。処理期間は各温 0 Eヨ 1 0日間で、各 3gを乾熱処理後速やかに冷却し、度 1- ぺレニアルライグラスのエンドファイトは、植物体に耐虫性などを付与する一方、家畜にアルカロイド中毒症園芸用培養土を充填した育苗箱に各 1 0 0粒播種し、昼温 100 アル状などの害を及ぼす可能性を有しているし 5、6、 2 0C、夜温 1 6Cで育苗した。出芽率は播種後 2 8日目に調カロイド産生のないエンドファイト(以下、エンドセー査し、エンドファイト保有個体率は播種後3 5日目に調査フ)の研究も進め.られてきているが瓜日)、現時点では家した。 0 0 エンドファイトの検出は、幼苗の地際の葉鞘裏表皮を畜の飼料となる農業用のペレニアルライグラス品種は、安全性の面からエンドファイトフリーである方が望まし 2.5%ローズベンガル・ 5%アルコール水溶液で、染色し、いと考えられる 5、9)。しかしながら、多様な遺伝資源を各5 0個体を 2 0 0 4 0 0倍で顕微鏡観察した。出芽した幼苗 0 9 8 5 7 3 6 枝幸郡浜頓別町) 北海道立天北農業試験場 C T e n p o k t iA g r i c u l t u r a lExperimentS t a t i o n，Hamatonbetsu，Hokkaido，0 9 8 5 7 3 6Japan *現北海道立根釧農業試験場 C 0 8 6 1 1 5 3 標津郡中標津町桜ケ丘) * KonsenA g r i c u l t u r a lE x p e r i m e n tS t a t i o n，N a k a s h i b e t s u，Hokkaido，0 8 6 1 1 5 3Japan 「平成 1 3 年度研究発表会において発表」 -39- 北海道草地研究会報 3 6( 2 0 0 2 ) のうち、葉鞘裏表皮からエンドファイトが検出された個日間のうちに急激に低下し、 8日間処理で全ての供試材体の割合をエンドファイト保有個体率とした。 5 0 個体を料で 0 %に至った。エンドファイト保有個体率が 0 %に観察終了した時点で、エンドファイト保有個体率が 0 %で至るまでの 8 0C乾熱処理日数は、供試材料間でもばらつあったものは続けて 8 0 個体まで調査した。きが大きく、「マンハッタン mJでは 2日目、最も日数 0 殺菌に要する日数及び出芽率に関与する要因を解析するため、各材料の千粒重及び、水分含量を調査した。種子の水分含量は、恒温乾燥機を用いて 7， .1 0日間、恒量に 100 t ; g:I ~ 3 4 :9 a 100 !92 草山~忌Z 134 ! S 4 主j80 0 達するまで 1 0 5Cで乾燥し、測定した。熱処理 2年後の 2 0 0 1年 1 1月 . . . . . . ，1 2月にかけて、系統 A及びド ~1寸判2 トトトmJ::i iSR-4200J の発芽勢、発芽率及び出芽率の調査を行っ u λ H -2 また、 8 0C乾熱処理種子の保有性を確認するため、乾 0 0 2 0 た。発芽勢及び発芽率は、蒸留水を浸した滅菌櫨紙上に置床後、 2 5C環境下で 5日及び 1 4日目の発芽個{桔恰を、 0 o 2 3 4 5 6 7 60"C種子乾終処理回数(日) 1 それぞれ発芽勢及び発芽率として調査した。出芽率は育苗箱に播種し、 1 9 9 9年 1 1月と同様に、播種後 2 8日目に調 8 9 10 E保有個体率￨ト+ー出芽. . 1 ト図1 .6 0C種子乾熱処理が出芽率及び出芽幼苗のエンドファイ 0 卜保有個体率に及ぼす影響・:乾熱処理 O日と 5%水準で有意義日:乾熱処理 O日と 1%水準で有意義査した。結果供試材料の千粒重は1.8 " " " ' 3. 4g で、水分含量は 1 0 . 7， . 16.5%の範囲にあった。 s 4 重5 4 量日亙s 3 、図 1に、エンドファイト保有種子において、 6 0C乾熱 0 。 •。 4 B E ー処理日数の経過に伴う、出芽率の変化を示した。 6 0C乾 •s z 0 Z E ι 」 8 0 2 4 6 0 ，、、、熱処理は、出芽率への影響は認められなかった。エンド 4 e t ι 啄樟恩 v J 4 v 『 H r a 重 A ファイト保有個体率に関しては、 6 0C乾熱処理の効果は 0 4 2 8 t 0 ' 翠 a k r " 内 τ 認められたものの、完全な殺菌はできず、 1 0日間の処理でも 30%程度の低下にとどまった。 7 0C乾熱処理の結果を図 2に示した。 7 0C乾熱処理は、 0 0 700C種子乾鶴処理日数(目) 出芽率への影響はほとんど認められなかった。エンドファ￨ー←出芽率イト保有個体率に対しては、 7 0C乾熱処理の効果はかな 0 1 図2 .7 0C種子乾熱処理が出芽率及び出芽幼苗のエンドファイト保有個体率に及ぼす影響乾熱処理 O日と 5%水準で有意義 . .乾熱処理 O日と 1%水準で有意義 0 り認められたものの、完全な殺菌はできず、 1 0日間の処理で 44%程度の低下であった。 80C乾熱処理の結果を図 3に示した。出芽率は、 8 0C 0 0 トー-E保有個体率￨乾熱処理日数が長くなるにつれて、低下する傾向が認めドファイト保有個体率は、 8 0C乾熱処理日数が、 1， .2 0 100 100 0日間の処理では 16%の低下が認められた。エンられ、 1 ! 80 e 昨挙表1 .8 0C種子乾熱処理における「フリー化日数」に係わる要 0 フリー化日数含水率% 水分量 g/千粒千粒重 g 4 0 2 ~ 0 . 5 3 0 . 8 6 .• 0 . 6 3 出芽率 0 . 6 6 I 乙 ι 20 λ20 H 0 . 0 1 0 . 5 8 0 . 9 1 . . 0 . 3 6 0 . 6 1 僑 40 、 F 、含水率%水分量 g / 干粒千粒重 g 0 . 2 0 60 ~ ー」因の相関関係表 r= 恩 60 . k J : 属医 o 0 1 2 3 4 5 6 7 80"C種子酬処理日数(日) **:1%水準で有意 _910 トト E保有個体率￨ト←出芽率￨図3 .8 0C種子乾熱処理が出芽率及び出芽幼苗のエンドファイト保有個体率に及ぼす影響 .乾熱処理 O日と 5%水準で有意義 0 注) I フリー化日数」は出芽個体のエンドファイト保有個体率が 0%に至った種子乾熱処理日数 8 “:乾熱処理 O日と 1%水準で有意義 -40- 佐藤・竹田:種子乾熱によるエンドファイトの殺菌表2 .8 0C乾熱処理種子における発芽能力の変化 0 ' 9 9 .1 1出芽率 % 系統 A SR4 2 0 0 ' 01 .1 1発芽勢 ' 01 .1 1発芽率 ' 01 .1 2出芽率無処理乾熱無処理乾熱無処理乾熱無処理乾熱 9 7 9 7 9 6 8 3 7 2 9 7 3 9 4 5 8 7 9 8 7 3 8 4 9 3 9 2 9 1 7 9 注 1:乾熱 ( 8 0C) 処理は ' 9 9 .1 1に系統 Aは5日間、 SR4 2 0 0は7日間処理(それぞれフリー化に要 0 する日数) 注 2:発芽勢は滅菌櫨紙を用いて 2 5Cにおいて 5日間、発芽率は 1 4日目に調査 0 注 3:出芽率は園芸用培養土を用いて、 2 0Cにおいて、 2 8日目に調査 0 を必要とした「アドベント」及び「アクセント」では 8 聞の乾熱処理では、エンドファイトの殺菌は可能で、発日を要し、何らかの要因があることが示唆された。芽勢は低下するものの、出芽率は 16% 程度の低下にとどそこで、エンドファイト保有個体率が 0 %に至った日まった。実験に供試した材料の点数が少なく、材料の採数(以下、「フリー化日数J ) と、種子の含水率(%)、種から乾熱処理までの期間(種子の a g e ) が全て同じで千粒当たりの水分量 (g)、千粒重 (g) 及び出芽率あったことから、「フリー化日数」を決定する要因を明 (%)との相関関係を表 1に示した。「フリー化日数jは、らかにするまでに至らなかったが、千粒重及び水分量がいずれの調査項目とも有意な相関関係は認められなかっ「フリー化日数」に影響している傾向は認められた。たが、水分量及び出芽率と負の関係がある傾向が示された。従って現段階では、種子を十分に乾燥させておくことを前提とし、大量の種子を乾熱殺菌処理をする前に、ま r sR-4200J を材料に、 8 0C乾 1 0日前後の 8 0C乾熱処理をず‘少量の種子について、 1- 熱処理によりフリー化処理した種子の保存'性について示施し、「フリー化日数」とその際の出芽率又は発芽率を 9 9 9 年1 1月に 97%の出芽率であっした。無処理種子では、 1 調査する必要がある。そして、その出芽率又は発芽率にたが、 3C (相対湿度31%) で 2ヶ年程度保存した結果、合わせて補正(増量)した必要量の種子を、極力薄く広表 2に、系統 A及び 0 0 0 出芽率の低下は 4--5%とわずかなものであった。 8 0C げて「フリー化日数」乾熱処理する方法が望ましい。少乾熱処理によりフリー化処理した種子についても、同様量種子の処理・調査から、大量種子の処理終了まで、ほに 4--5%の低下であり、乾熱処理後 2年程度の保存は、ぼ4 0日程度かかる行程となる。 0 エンドファイトは種子伝搬することから 1)、種子殺菌保存環境が適切であれば、出芽率に対する影響は、小さなものであると示唆された。を施した以降の世代は、エンドファイトフリーとなる o また、 8 0C乾熱処理の、発芽勢及び発芽率に対する影育種材料のエンドファイトを殺菌する場合は、選抜サイ響を、 2年間保存した種子について表 2に示した。発芽クルのなるべく早い段階で行うことが望ましい。このこ勢は 46--54%と低下が著しかったが、発芽率は 14--16% とにより、エンドファイトに影響されずに、遺伝的能力程度の低下にとどまった。の評価による選抜が可能となる。 0 考引用文献察エンドファイトの殺菌方法は、植物体に対する殺菌剤 1) BaconC .W.，P .C .Lyons，J .K .P o r t e randJ .D . 処理 2、5、12)、種子の殺菌剤処理 2，3，5，9、12)、種子の高湿度 19 8 6 )E rgott o x i c i t yfrome n d o p h y t e Robbins ( 処理や温水処理 3、5、ゆなどが知られている o エンドファ i n f e c t e dg r a s s e s:ar e v i e w .AgronomyJoumal78，イトによる耐性付与やエンドセーフに関する研究などで 1 0 6 1 1 6 . は、植物体に殺菌剤を浸潤させる方法が用いられている 2) Harvey 1 .C .， L .R .F l e t c h e r and L .M.Emms 場合が多い。一方、大量の材料を扱い、家畜の飼料とな ( 1 9 8 2 ) E f f e c t so fs e v e r a lf u n g i c i d e s on t h e る品種の育成を目標とする育種現場においては、予期し Loliumendophytei nr y e g r a s sp l a n t s，s e e d sandi n ないエンドファイトの侵入を防ぐため、種子の殺菌が望 e a l a n dJ o u r π αl0 1A g r i c u l t u r a l c u l t u r e . New Z R e s e αr c h25，6 0 1 6 0 6 . ましいと考えられる o 著者らは過去に、 9 0C以上の高温で、短時間 ( 3 0分) e a t h e rM.Nott and G .C .M.Latch ( 19 9 3 ) A 3) H の種子乾熱処理を試みたが、殺菌と発芽能力の維持がで s i m p l emethodo fk i l l i n ge n d o p h y t ei nr y e g r a s s 0Cで 2--8日きる手法は確立できなかったヘ今回、 8 r o c e e d i n g s0 1 TheS e c o n dI n t e m a t i o n a l s e e d .P 0 0 -41- 北海道草地研究会報 3 6( 2 0 0 2 ) SymposiumonAcremonium/Gr αs sI n t e n αc t i o n s . 1 4 1 5 . n o r t h e r nandc e n t r a lr e g i o n so fHokkaidoandt h e ， 4) H i r o n o r iKOGA，TakashiKIMIGAFUKURO，Takao 19 9 3 ) TSUKIBOSHI and Tsutomu UEMATSU ( p r e v e n t i o n methods i n f e c t e ds e e d s . Joumal 0 1 Hokk αi d oS o c i e t y0 1Gr α ，s s l a n dS c i e n c e2 9，7 8 8 4 . 9 8 ) 多発するエンドファイト感染牧乾 1 0 ) 雑賀優(19 ，2 1 2 5 . 草による牛の中毒.畜産技術 6 l n c i d e n c eo fe n d o p h y t i cf u n g ii np e r e n n i a lr y e αl s0 1t h ePhytop αt h o l o g i c α J g r a s si nJ a p a n .Ann 1 1 )佐々木亨、岡崎博、笠井恵里 ( 2 0 0 0 ) フェスク S o c i e t y0 1~αpαn 5 9，1 8 0 1 8 4 . 類及びライグラス類の牧草用国内流通品種における 5) Latch G .C .M. and M.J .C h r i s t e n s e n ( 19 8 2 ) 6 エンドファイト感染の調査.日本草地学会誌 4 Ryegrassendophyte，i n c i d e n c eandc o n t r ol . Ne ω ( 別 ) ， 1 6 0 1 61 . Z e a l a n dJoumal 0 1A g r i c u l t u r a lR e s e αr c h2 5， 4 4 3 4 4 8 . 1 2 )S i e g e lM.R.，D .R .Varney，M.C .Johnson，W.C . 6) Latch G.C .M. ( 19 8 5 ) Endophyte f u n g ia f f e c t I IandJ .R .Hardison ( 1 9 8 4 ) A fungalendophyte e α J αnd growth o fp e r e n n i a lr y e g r a s s . New Z o ft a l lf e s c u e :e v a l u a t i o no fc o n t r o l methods. Nesmith，R .C .Buckner，L .P .Bush，P .B .Burrus， αl0 1A g r i c u l t u r αlR e s e αr c h2 8，1 6 5 1 6 8 . Joum 7) LatchG.C .M. ( 1 9 8 7 )l n c i d e n c eo fe n d o p h y t e si n Phytop αt h o l o g y7 4，9 3 7 9 41 . ， s e e d s from c o l l e c t i o n so f Lolium and F e s t u c a 要摘 αl s0 1A p p l i e dB i o l o g y1 1 1，5 9 6 4 . s p e c i e s .Ann 種子乾熱処理を用いた、ペレニアルライグラス種子に 8) N a r i c h i k aSATO，MasaichiTOGAWAandTsutomu おけるエンドファイト殺菌法について検討した。 KITAMORI ( 1 9 9 3 )Detectiono fendophytef u n g ii n 6 0C及び7 0Cの種子乾熱処理は、 1 0日間処理しても出 p e r e n n i a lr y e g r a s s ( L o l i u mp e r e n n eL . ) s e e d s 9 及び4 4 芽個体におけるエンドファイト保有率が、各々 2 1 Hokk αi d o with s e v e r a lv a r i e t i e s . Joumal 0 %低下したのみであった。 8 0Cの種子乾熱処理は、 2 - S o c i e t y0 1G r l αs s l a n dS c i e n c e2 7，7 0 7 3 . 8日間の処理期間で、エンドファイトの完全な殺菌が可能 0 0 0 9) N a r i c h i k aSATO，MasaichiTOGAWA，Tsutomu K であるが、同時に発芽率は 16% 程度の低下が認められた。 19 9 5 )l n c i d e n c e I T AMORIandFumiakiAKIYAMA ( 8 0C乾熱殺菌処理後の種子は、 3Cで湿度31%程度の o f endophyte f u n g i on f o r a g eg r a s s l a n d i n 0 0 環境下において、発芽率等が 2ヶ年維持された。 -42-