「生命科学特別講義Ⅱ 」 １．地衣類概説Ⅰ (9/4 ①) ２．地衣類概説Ⅱ (9/4 ②) ３．地衣類の分類・系統と進 化 (9/4 ③) ４．地衣類の一次代謝 (9/4 ④) ５．地衣類の環境耐性 (9/4 ⑤) ６．地衣類の二次代謝 (9/5 ①) ７．地衣成分の生物活性 ８． 地衣類観察会 （9/5 ③-⑤) ： 羅漢の里） ９ ．地衣類の培養と地衣成分 生産 (9/6 ①) 10．地衣類の形態形成と人工 栽培 (9/6 ②) 11．地衣類の利用 (9/6 ③) 12．地衣類グループ討論 (9/6 ④) 13．地衣類グループ発表 (9/6 ⑤) (9/5 ②) 2015/10/1 1 地衣類の二次代謝 地衣成分 地衣成分とは 地衣成分の役割 地衣成分の生合成 地衣成分の分析 呈色反応 顕微結晶法 薄層クロマトグラフィー(TLC) 高速液体クロマトグラフィー(HPLC) HPLC 分析の実際 2015/10/1 2 芳香族地衣成分 De ps ide s Dibe nzofurans O CH 3 COOH O OH O CH3 HO O OH CH3 H3CO CH3 HO Naphthoquinone s O O OH O HO OH O CH3 H3C COOH O H3C Hypocetraric acid COOH COOH OH O OH O O CH3 CH3 O O Rhodocladonic acid Anthraquinone s OH CH3 OH HO Alectorialin Xanthone s OH HO CHO Congrayanic acid M onocyclics OH COCH3 OH HO H15C7 Picrolichenic acid Be nzyle s te rs CH3 O O COOH Pulvinic acid Diphe nyle the rs OH H3CO H11C5 COOH OH Usnic acid De ps idone s O O COCH3 OH Evernic acid O O OH H3COC O H3CO De ps one s H11C5 CH3 CH3 Pulvinic acids Chrom one s OH OH OH O COOH H3CO HO OH Orsellinic acid 2015/10/1 H3CO O Lichexanthone OCH3 CH3 O Parietin H3CO O CH3 Eugentiol 3 地衣成分の役割・有用性 環境耐性 対昆虫防御 ラジカル補足 対かび防御 紫外線防御 対細菌防御 増殖制御 対植物（蘚苔類）防御 合成制 御 薬・染料・香料 2015/10/1 4 地衣成分の特徴 ・１０００種類以上の化合物が知られている ・菌が産生する ・地衣類特有の化合物が多い ・分類のマーカーの一つとして用いられる ・生物活性を持つ 2015/10/1 5 地衣成分の役割 2015/10/1 6 芳香族地衣成分と化学分類 Colored Lichens Dibenzofurans O CH 3 Anthraquinone s OH O OH H3COC CH3 OH HO H3CO O Usnic acid OH COCH3 CH3 O Acetate-Malonates Parietin Xanthone s CH3 O Common Lichens OH De ps ide s CH3 H3CO O Lichexanthone OCH3 Pulvinic acids O 2015/10/1 OH Evernic acid H3CO O Peltigerales COOH O O No phenolics CH3 OH OH CH3 O COOH O Pulvinic acid Letharia Vulpicida Pseudocyphellaria De ps idone s HO OH O CH3 CH3 H3C COOH Hypocetraric acid 7 芳香族地衣成分の生合成 SCoA SCoA SCoA SEnz HOOC CO CO CO Polyketide synthase O O SCoA SCoA SCoA CO ACoS Polyketide synthase OH CO-SEnz COOH COOH COOH CO O CO 7CO2 CO O O O CH3 HO CH3 CO O Emodin COOH COOH COOH Polyketide synthase H3C S-CoA CO-S-CoA CO HOOC 3CO2 ACo-S CH3 O O CO Anthraquinones Polyketide synthase CH3 COOH CO CO-SEnz EnzSH COOH OH OH HO CH3 Orsellinic acid S-CoA OH O CH3 Acetyl CoA O EnzSH COOH Depside synthase CH3 COOH H2O Malonyl CoA HO COOH OH Orsellinic acid HO Dibenzofuran synthase OH Orsellinic acid CH3 COOH CH3 CH3 O OH OH Lecanoric acid H2 HO H2+CO2 O O O HO Depsidone synthase 2015/10/1 CH3 COOH OH O CO2 H3C HO O OH COOH 3,5,3'-Tridechroro-2'-demethyl-1'-carboxyfulgidin Depsides CH3 Dibenzofuran synthase Depsidones Hypostrepsilic acid Dibe nzofurans 8 Cristazarinsの生合成経路 ポリケチド合成経路 cristazarins ポリケチド合成酵素（PKS）が関与 2015/10/1 9 ポリケチド合成酵素（PKS）遺伝子 PKS AT ACP KS KR DH ER AT KS よく保存されたKS領域を増幅 ACP アシル基転移酵素 アシルキャリアータンパク質 KS ケトアシル合成酵素 KR ケトアシル還元酵素 DH 脱水酵素 ER エノイル還元酵素 この配列を基に全長遺伝子 をクローニング 2015/10/1 10 増幅産物の塩基配列と 予想されるアミノ酸配列 1 GAYCCGCGGTTTTTCAATATGTCCCCACGAGAAGCCACGCAAACTGATCCCATGCATCGGCTCGGTCTAGCGAGCGCCTACGAAGCCCTAGAAATGGCAG P R F F N M S P R E A T Q T D P M H R L G L A S A Y E A L E M A G 100 101 GCTATGTACCAAACCGAACCCCCTCCACAAAACTTGACAGAATTGGCACGTTCTATGGTCAAACCAGTGACGATTGGCGAGAAATCAATGAAGCTCAGGA Y V P N R T P S T K L D R I G T F Y G Q T S D D W R E I N E A Q D 200 201 TATAGACACGTACTTCATTACTGCTGGTGTCAGAGCGTTCGCACCAgtgagcaacacttccgcctagaaaaccccttgggatctgctgatagagaattag I D T Y F I T A G V R A F A P 300 301 GGTAGGATCAATTACTACTTCAAGTTTAGTGGTCCCAGCTTTAGCATCGACACTGCCTGCTCCTCAAGTGCCGCAGCTTTACAGCTCGCATGCACGTCCT G R I N Y Y F K F S G P S F S I D T A C S S S A A A L Q L A C T S L 400 401 TGTGGGCTGGTGACTGCGATACCGCCGTAACAGGGGGTCTCAATGTGATGACCAATTCTGACATCTTCGCTGGGCTCAGCCGGGGTCAATTTCTGTCCAA W A G D C D T A V T G G L N V M T N S D I F A G L S R G Q F L S K 500 501 GACAGGAAATTGTCAAACGTTTGATAACGACGCAGATGGGTACTGCCGAGGCGATGGTATCGGCAGTTTAGTTATCAAGCGTTTAGACGACGCGTTGTTC T G N C Q T F D N D A D G Y C R G D G I G S L V I K R L D D A L F 600 601 GACAACGATCGTATCCTGGGCGTCATCCTCGAGACGGCAACGAATCACTCTTCCAATGCGATTTCTATCACCCATCCTCATGCACCAACGCAGGAGCAGC D N D R I L G V I L E T A T N H S S N A I S I T H P H A P T Q E Q L 700 701 TCTTTAAGAAAGTCTTGGATGACGCTGGTCTTGACCCGCGGTTTTTCAACATGTCGAAATGCACGGCACCGGCAC F K K V L D D A G L D P R F F N M S K C T A P A 775 775 bp / 239 AA 2015/10/1 11 PKS 遺伝子のKS領域の分類 Xanthoparmelia tuberculiformis Botryotinia fuckeliana Xylaria sp. Neurospora crassa Vulpicida pinastri (CET/PI) Monascus purpureus Xanthoparmelia orientalis Lobaria orientalis Aspergillus nidulans3 Aspergillus nidulans1 Aspergillus fumigatus1 Aspergillus fumigatus2 Aspergillus parasiticus2 Aspergillus nidulans2 Aspergillus terreus Gibberella fujikuroi2 Gibberella fujikuroi1 Aspergillus oryzae Xanthoria parietina 2015/10/1 12 地衣類の二次代謝 地衣成分 地衣成分とは 地衣成分の役割 地衣成分の生合成 地衣成分の分析 呈色反応 顕微結晶法 薄層クロマトグラフィー(TLC) 高速液体クロマトグラフィー(HPLC) HPLC 分析の実際 2015/10/1 13 呈色反応とは ・地衣類には近縁の種類で成分を異にするものがある。 ・この成分の差が簡単な呈色反応で区別できることがあ る。 ・地衣類の同定に呈色反応が１９世紀中葉から利用され ている。 ・呈色反応の種類 Ｃ反応：次亜塩素酸ナトリウムの飽和水溶液 Ｋ反応：５％水酸化カリウム水溶液 Ｐ反応：パラフェニレンジアミンのアルコール液 2015/10/1 14 呈色反応の実際 近縁で成分を異にするアンチゴケとサボテンアンチゴケ Ｃ－：アンチゴケ 2015/10/1 Ｃ＋赤色：サボテンアンチゴケ 15 顕微結晶法とは ・地衣類に含まれる地衣成分をアセトンなどの溶媒に溶 かし、スライドなどのガラス上で溶媒を蒸発させてア セトンエキスを得る。 ・このアセトンエキスをメスまたはカミソリで掻き取り、 別のスライドに移して、ＧＥ液（酢酸とグリセリンの 混合液）に封じ、少し暖めて溶かし、冷却して再結晶 させる。 ・またはアセトンエキスに各種の試薬を加え、錯塩を作 らせ、その結晶形を観察する。 ・各結晶は特異的な形状をとる場合が多いので簡易に成 分を同定する。 2015/10/1 16 顕微結晶法の手順 2015/10/1 17 顕微結晶法による結晶のいろいろ 2015/10/1 18 クロマトグラフィー 被検物質Ｂ 固定相 担持体 物質の担体と溶媒への吸 着力の違いにより分離す る 流動相（展開溶媒） 担持体 固定相 固定相 担持体 固定相 担持体 ぺーパークロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィー 高速液体クロマトグラフィー ガスクロマトグラフィー 2015/10/1 19 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） ＴＬＣ ：シリカゲル 流出溶媒 ：Ａ トルエン：ジオキサン：酢酸 = 180:45:5 Ｂ‘ ヘキサン：メチル-t-ブチルエーテル：ギ酸 = 140:72:18 検出 ：10%硫酸噴霧⇒１１０℃加熱 特徴 2015/10/1 保持距離（Rf) 呈色 全化合物 20 薄層クロマトグラフィーの実際 2015/10/1 21 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） 装置 カラム ：島津製作所製 HPLC 10A-DP ：YMC-Pack ODS-A, 150 x 4.6 mm I. D., S-5 µm, 12 nm 流出溶媒 ：MeOH:H2O:H3PO3=80:20:1、流量：1 ml/min カラム温度 ：40℃ 検出器 ：フォトダイオードアレイ、検出波長：180-700 nm（254 nm） 特徴 2015/10/1 保持時間（Rt) 定量性 ＵＶスペクトル 22 高速液体クロマトグラフィーの実際 形態では同定が困難な地衣類の同定 シラチャウメノキゴケ（Ca）とタナカウメノキゴケ（Ct) 67 個体標本 (愛知、三重、滋賀、京都、奈良、大阪、兵庫、 広島、山口、福岡） 2015/10/1 23 シラチャウメノキゴケとタナカウメノキゴケ 分類：ウメノキゴケ科ハイイロウメノキゴケ属 特徴：灰白色地衣体、粉芽 成分： ペルラトール酸 ジバリカート酸 シラチャウメノキゴケ の粉芽 2015/10/1 シラチャウメノキゴケ タナカウメノキゴケ 24 ●シラチャウメノキゴケと●タナカウメノキゴケの ＨＰＬＣ C3H7 C3H7 COOH O O H3CO OH OH Divaricatic acid C5H11 COOH C5H11 O O H3CO OH OH Perlatoric acid 2015/10/1 25 ●シラチャウメノキゴケと●タナカウメノキゴケ の産地分布 ● シラチャウメノキゴケ ● タナカウメノキゴケ 2015/10/1 26
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