カンキツ果実に含まれる蛍光物質の特定共同研究機関：東北大学，愛媛大学背景選果場での検査作業１次選別腐敗，日焼け，傷などの検査 Rotten part 糖度測定糖度，酸味などを測定外観測定傷，形状などを測定２次選別箱詰め前の最終検査 Normal part 腐敗部に紫外線を照射すると蛍光反応を示す Fig. Rotten orange カンキツ果皮の蛍光物質の特定実験Ⅰ ミカンの蛍光物質の分析 蛍光物質の抽出方法ヘキサン供試材料エバポレーターサンプル温州ミカン南柑20号の果皮 (フラベド層も含む)1kg 果皮の粉砕果皮物質の抽出シリカゲルを詰める提供 EYELA 分液ロート提供アズワン株式会社減圧濃縮液液分配吸着剤ガラスカラム抽出液メタノール層について分離提供アズワン株式会社液体クロマトグラフィー溶媒薄層クロマトグラフィーサンプルＲｅｌａｔｉｖｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ蛍光物質の解析結果 Methyl ether group Aromatic ring  NMR解析結果より，フラボノイドで糖がなく、メチルエーテル化されている可能性がある．  ミカンの蛍光物質は複数である.  シネセチン，タンゲレチン，ノビレチン，ヘプタメトキシフラボンの可能性がある．混合液とサンプルを同定 Chemical sift Fig. NMR spectrum OMe H O C H H OMe H OMe OMe OMe OMe OMe H OMe Fig. Benzene (left) and methyl ether (middle) and flavonoid (right) H OMe H OMe Fig. Sinenstein (left) and tageretin (right) Me = CH3 実験Ⅱ 腐敗部位検出実験 蛍光成分全体での励起，蛍光スペクトル 8 A bsolute intensity 7 A bsoulute Intensity 14 Peak 6 5 4 3 2 1 12 Effective area 10 8 6 4 2 0 0 400 450 500 550 W avelength(nm ) Fig. Fluoresce spectrum 600 300 350 400 450 W avelength(nm ) Fig. Excitation spectrum 500 ＜目的＞ ミカン果皮より抽出されたサンプル(３-２)中に含まれる分子の分子量をMSで測定し、 推測される構造と比較することで、蛍光物質の分子式を決定する。 NMRの結果からサンプル中に含まれる蛍光物質は、 Nobiletin,Tangeretin,Sinesetin,Heptamethoxyflavoneの いずれかであることが推測されている。（山本君卒論より） 各分子の構造、及び分子量は以下の通りである。 Tangeretin Sinesetin Nobiletin 3,5,6,7,8,3’,4’- 372.373 372.373 402.399 Heptamethoxyflavone 432.425 その他の構造異性体あり サンプル3-2及び、標品（Nobiletin,Tangeretin）について質量分析を行った Nobiletin,Tangeretinについては標品を購入できたが他二つについては、購入できなかった（販売していなかった）。 ＜試薬＞ ・サンプル3-2 ・Nobiletin(Wako 149-07521) ・Tangeretin(Wako 208-15671) ・蒸留メタノール（溶媒） ＜装置＞ Applied Biosystems社製 API 2000 LC/MS/MS ・四重極型 ・イオン化法：ESI法 ＜測定結果-Blank(MeOH)＞ ブランクに多くのピークが現れた→装置の汚れが原因？ この結果よりサンプルは250~500amuの範囲(赤枠内)について測定を行うこととした。 ＜測定結果-Tangeretin（標品）＞ 373.2にピークが見られる。→Tangeretin（分子量: 372.3）を観測 （プロトン分，分子量が大きく観測されている） ＜測定結果-Nobiletin（標品）＞ 403.2にピークが見られる。→Nobiletin（分子量： 402.3）を観測 ＜測定結果-sample＞ パルミトイル酸？ Blank由来 Heptamethoxyfavone Nobileti n Tangeretin Tangeretin,Nobiletinのピークはほとんど見られない。 433.2のHeptamethoxyfavoneのピークが見られる。 257.0が主ピークになっているが、これはパルミトイル酸かもしれない。（パルミトイル酸は蛍光を持たない） まとめ ・サンプル(3-2)、および標品（Tangeretin,Nobiｌetin）のMSを測定した。 →標品で理論的なピークと実測したピークが一致した。 →サンプルでは、Tangeretin,Nobiletinのピークはほとんど観られなかった。 →サンプルでは、433.2の位置にピークが観れらた。  この分子量はHeptamethoxyflavoneと一致する。 →サンプルで、257の位置にピークが観られたが、これはパルミトイル酸かもしない。パルミトイル酸は蛍光を持たない。れ ・蛍光物質の同定 →今回の測定から、蛍光物質の正体は４つの候補の内、 Heptamethoxyfavoneである可能性が高い。蛍光物質の同定のためには、 Heptamethoxyfavoneの純品を用意し、その励起波長及び蛍光波長を測り、ミカンのものと一致するか確かめるのが、最も簡単な方法であると考えられる。 → Heptamethoxyfavoneには構造異性体が存在する。 Heptamethoxyfavoneの詳しい構造まで決めるためにはサンプルの精製度をあげてNMRなどを測定しなおす必要がある。今回の実験にあたり、参考にした文献では3,5,6,7,8,3’,4’ Heptamethoxyflavoneの存在が報告されている。 参考文献 1：J. Agric. Food Chem. 1987, 35, 525-529 2:J. Agric. Food Chem. 1994, 42, 1697-1700 参考： Heptamethoxyfavoneの構造異性体 ３，３′，４′，５，５′，７，８‐Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ ５，６，７，８，３′，４′，５′‐Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ ３，３′，４′，５，５′，６，７‐Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ ２′，３′，４′，５，５′，６，７‐Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ ３，５，６，７，８，３′，４′‐Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ ２′，３′，４′，５，５′，７，８‐Ｈｅｐｔａｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ