アイスプラントのリン酸輸送体 プロモーター領域の単離 41328 中俣浩介 指導教官 是枝晋 CAM型代謝経路 Night CO2 Day vacuole PEP CO2 Malate Pyruvate G6P Pi GPT G6P Pi Pi G6P GPT Pi G6P 3-PGA Starch Calvin F6P chloroplast cycle RUBP 背景 • アイスプラントは塩ストレスによって代謝 経路がC3型からCAM型に変わる • GPTの遺伝子GPT2はCAM化によって 発現が誘導される 目的 • GPT2のプロモーター解析を行い、CAM化 を発現レベルで制御するメカニズムを解明 するためにGPT2上流領域を単離 主な実験方法 • 葉からゲノムDNAを抽出 • ゲノミックサザンハイブリダイゼーション • イントロンの配列決定 • インバースPCRによる上流領域の増幅 ゲノミックサザンの方法と結果 GPT2 cDNA 1 500 1000 1500 kb 23 15 9.4 ORF 800bp プローブに使用したDNA断片 • GPT2はシングルコピーである • 単離に適したGPT2断片を生じる制限 酵素を同定することはできなかった GPT2の構造 1 500 1000 Sac I アイスプラント 1500 2000 EcoR I Pst I Sac I Hind III 2500 Xba I アラビドプシス Sac I EcoR I Hind III Pst I Xba I exon intron を用いてゲノムDNAを切断、インバースPCR インバースPCRによる上流領域の増幅 ゲノムDNA 上流領域（未知） GPT2（既知） 制限酵素処理 1回目のPCR セルフライゲーション 2回目のPCR (nested PCR) インバースPCRの結果 kb 1.3 1.0 0.7 まとめ • GPT2はシングルコピーである。 • アイスプラントとアラビドプシスのGPT2はイ ントロンの位置が保存されている。このこと はイントロンが二種の分化以前から存在し ていたことを示唆する。 • GPT2の上流領域を含むと思われるDNA断 片を単離した。塩基配列を確認中。
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