+ 哺乳類Na /胆汁酸輸送体と相同性を持つアイスプラント膜タンパク質の解析指導教官：大西純一 03SB005 大石真久 CAMの代謝経路の模式図 CO 2 ãCçE ñÈ íã ãCçE ÉäÉìÉSé_ HCO 3PEP NAD(P)-ME PEPC ÉIÉLÉTÉçê|é_ Pi 3-PGA ÉäÉìÉSé_ ÉäÉìÉSé_ ÉsÉãÉrÉì é_ PEP CO 2 3-PGA ât ñE PPDK G6P ÉsÉãÉrÉì é_ G6P PEP 3-PGA Pi G6P Pi ÉfÉìÉvÉì ótóŒëÃ G6P C3âÒòH ÉfÉìÉvÉì ótóŒëÃ ÉgÉäÉIÅ[ÉXÉäÉì é_ ÇÕÉsÉãÉrÉìé_óAëóëÃÇ¾ÅA Å@ÇÕÉäÉìé_óAëóëÃÇ¾ï\ Ç• ÅB PEPC: ÉzÉXÉzÉGÉmÅ[ÉãÉsÉãÉrÉì é_ÉJÉãÉ{ÉLÉVÉâÅ[É[, NAD(P)-ME: NAD(P) ÉäÉìÉSé_çyëf , PPDK: ÉsÉãÉrÉì é_ÉäÉì é_ÉW ÉLÉi Å[É[, Pi: ñ•ã@ÉäÉì é_, 3-PGA: 3- ÉzÉXÉzÉOÉäÉZÉäÉì é_, G6P: ÉOÉãÉRÅ[ÉX6-ÉäÉì é_ McNBT1の特徴と Flaveria属でのNBTの発現量の違い McNBT1 (418 amino acids) Chloroplast transit peptide 8-10 transmembrane regions Asteraceae Flaveria pringlei (C3 plant) < trinervia (C4 plant) NBAT発現量植物と細菌のNBTホモログ NBT1ホモログ McNBT1 FtNBAT トマトジャガイモウマゴヤシオオムギコムギライ麦 AtSBF1 OsSBF1 AtSBF2 AtSBF3 AtSBF4 AtSBF5 細菌のNBTホモログ枯草菌サルモネラ菌 Synechococcus sp. WH8102 OsSBF2 など OsSBF3 OsSBF4 Chlamydomonas reinhardtii Cyanidioschyzon merolae CrNBT2 CmNBT1 CmNBT2 植物と細菌のNBTホモログの系統樹 AtSBF3 OsSBF3 Subgroup 3AtSBF4 1000 CmNBT1 998 AtSBF5 Subgroup 4 1000 Subgroup 1 OsSBF4 1000 TaNBT 1OsSBF1 McNBT1 1000 AtSBF1 FtNB AT (C4 ) LeNBT1 924 734 28 734 2 1000 AtSBF2 OsSBF2 467 506 765 Subgroup 2 0.1 CmNBT2 SynNBT CrNBT2 BsNBT StyNBT Mc: ÉAÉCÉXÉvÉâÉìÉg, Ft: Flaveria trinervia , At: ÉVÉçÉCÉkÉiÉYÉi , Os: ÉCÉl , Le: ÉgÉ}Ég, Ta: ÉRÉÄÉM, Cm: Cyanidioschyzon merolae , Cr: Chlamydomonas reinhardtii , Bs: åÕëêã€ , Sty: ÉTÉãÉÇÉlÉâã€, Syn: Synechococcus sp. WH8102 Ç¾ï\ Ç• ÅB McNBT1の異種発現 1. 大腸菌C43株 2. 出芽酵母INVsc1株 3. 高等植物タバコ大腸菌McNBT1発現ベクターの作製 McNBT1 Multiple cloning sites lac operator T7 terminator T7 promoter pET-21b(+) + lac operator T7 terminator 1 T B N Mc pET-NBT1 pET-NBT1を大腸菌C43株に導入した。 T7 promoter シリコンオイルろ過遠心法 2 mM Pyruvate 10 mM NaCl Strain + + C43/pET-21b(+) C43/pET-NBT1 + + + + - 98 µlÇÃëÂí ã€åúë˜ât 100 mM K2HPO 4 100 mM KH2PO4 1 mM MgSO4 100 µlÇÃÉVÉäÉRÉìÉIÉCÉã 20 µlÇÃ1 M HClO4 ピルビン酸の取り込み活性ピルビン酸の取り込み (nmol/mg protein) 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 -Na+ +Na+ C43/pET-21b(+) -Na+ +Na+ C43/pET-NBT1 それぞれの大腸菌株に、終濃度2 mM ピルビン酸を10 mM NaCl有無の条件下で、60秒間取り込ませた。酵母McNBT1発現ベクターの作製 T7 promoter Multiple cloning sites GAL1 promoter T7 promoter CYC1 transcription terminator pYES2 + M 1 T B cN + McNBT1 + His-tag GAL1 promoter CYC1 TT g a t s i H pYES2-NBT1 pYES2-NBT1を酵母INVsc1株に形質転換した。取り込み活性を測定中。タバコでのMcNBT1の異種発現 CaMV 35S McNBT1 ocs 3Õ pnos -n ptIInos3Õ pA27-NBT1-35S pA27-NBT1-35S タバコへ感染 T-DNAの挿入電気穿孔法 É^ÉoÉR å`éøì]ä• ëÃ GV3101/pA27-NBT1-35S Agrobacterium tumefaciens (GV3101 äî ) É^ÉoÉR (Nicotiana tabacum ) タバコ形質転換体 (9株)が得られた。タバコ形質転換体でのMcNBT1の発現確認野生型と形質転換体のタバコの葉から total RNAを抽出し RT-PCRによりMcNBT1のmRNAを検出した。まとめ 1. NBT1がよく保存されており、広く分布している。 2. McNBT1は大腸菌細胞で、有意な活性を示さなかった。 3. 酵母形質転換体を得た。 4. 転写レベルで発現しているタバコ形質転換株を得た。