4．小児膠原病における白血球および血小板産生アラキドン酸代謝物の役割をぎ雄平澄雄崎崎宮浜研究協力者共同研究者 1はじめとすう5−lip碑y genase代謝物およびPG 〔研究目的〕 E2，PGD2，PGF2αの重要なソースであり5），．膠原病，とりわ・けSLEでは，T−cell，B−cell ’血小板は12−HETE（121ipoxy genaもe代謝物）の機能異常があることがよく知られている。SLE およびトマンボキサンA2（TXA2）の主なソースの活動期には免疫グロブリンの産生は著明に増加 1である』6）。今回我々は，主に好中球と血小板由来しており，IgG分泌細胞数と疾患の活動性の間のAA代謝物をRadio immuno assay（RIA）およには強い相関があるといわれる1）。B−cel1機能は，びRadio metric assay（RMA）を使用して測定す T−cellの調節をうけるので，B−cellの機能充’ ’進には当然丁一cel1の異常も考えられる％近年1』・る；とにより，SLE，JRAにおけるAA代謝物 1の役割の評価を試みることを目的とした。 T，B−cell機能を調節する因子のひとつとし七，〔方法〕アラキドン酸（AA）代謝物が注目されてきた。 AA cyclooxy genase代謝物のうちプロスタグラ対象： SLE2名（うち1名ステロイド使用中），JRA の機能を抑制し，サプレッサーT−cell機能を充， 3名（うち2名アスピリン；ASA使用中）。コンンディンE2（PGE2），PGD2はヘルパーT−cell ト・一ルとして，健康成人より採取した静脈血を進させることが報告されている融。また，AA li− poxi genase代謝物のひとつ・イコトリエンB4 ：もちいた。（LTB4）、もサプレッサーT−cell機能を充進させ好中球および血小板の分離（図1）：るといわれている1％AA代謝の二つの代謝系（h− 3，8％クエン酸Na加静脈血（1：9）を室温で poxygenaseおよびcyclooxygenase）共に多く・10分間（700r．p，m．）遠沈し，．上清（platelet riCh の強力な生理活性物質を産生するが，これら活性：pla5mal FRP）より350μ」を分取，，血小板塑里副物質は，時には相反し，ある場合には協力的に働 1定，コラーゲンによる凝集能め検査のために使用きながら，生体防御機構の調節に何らかの役割を iした。残りのPRPは77mMEDTAを9：1とはたしている．ことはまちがいないと思われる。し． 1なるように加えたのち4℃へ冷却し，1700×Gでかし，SLE等免疫異常をきたす疾患においては， i30分間遠沈した。遠沈後の上清（platelet poor ．ステ目イド，および非ステ・イド系抗炎症剤を使 iPlas皿al PPP）は6keto−PGF、α測定用の検体と用する事が多く，これらの薬剤の2次的な影響も：して一20℃で凍結保存した。血小板pelletはED 、考慮する必要があるため，詳細なメカニズムの解 I TA加tris−buffered saline（pH7．4）で洗浄し， 1再度1700×G30分間遠沈し上清をすて，洗浄血小明はすすんでいない。ところで，生体のほとんどの細胞・臓器はAA 1板とし，12−HETE産生能測定のため一70℃で凍・代謝系を有するが，そのうち好中球はLTB・を 1結保存した。 PRP分取後の下層（血球層）には6％Dextran …salineを1：5になるように加えてゆっくりと撹＊佐賀医科大学小児科学教室・一 5一 P鮒0，5×107／m1・凹E凹［ tokeb且OOd （blood＝5。8器sOd量㎝c旦trote／9＝1〕 ↓ じぴドロロヒアゆハめドユサロヒドロロのヱのワ 14C−orGchldonlcocld（0，25りC1） supern。t痴（PR誤sed鞭nt Cq−10nOphore（10−5凹》 →臨1幡謡6驚de脚｛5謬L》・A23187 1 ｝冒守、糊松， 1 而x qm』stond for I hour ot rO㎝ t㎝e悶ture ↓ tokes叩ernOtGπt にのヒロゴロロもレリド且ncUbote fOr 15m皇n qt 37。C 弊擁！、、、、i1黙ll幣欝：1警欝 ↓ cont蜘恥EOTA Oω顕10・躍舶q ↓ i騰ln 詣1繭t2㈱ ↓ 翻ll？，要15；鑑，晶聯一 ↓ 1 Fヂ…耳丁岬甲ロロにヒにハぼサロにも品聰，躍・・6dl器〆レ1甜穐榊 ↓（res・1蝉th・・15mlmeth・n・η 1 0t4。c wosねce旦1s棋b剛 1 畑lce’と1 厘璽歪璽］・？t・旦魍・ SO丑vent 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1m旦のMEM中・に0．5x107の好中球をsuspen− reGct童on wos stoPped by odd重ng 13μl of IN HCl sionしたものを，5％CO2＋95％air中137℃で ↓ 培養し，14c−AA（o．25μCi）を加えると同時に extrocted with 2，5ml ethylocetote Caionophore A23／87（10』5M）で15分間刺激し ↓ t脚1ce たQ刺激後の上清を試験管に移し，IN HClでpH ↓T（res。lve四1thO・15mlmethonoD evoPorote under N2 streom を3．0とし，酢酸エチルで2度抽出した。抽出液 OPPlyonTLC so lvent ． l （ch且OrOfOrm＝methonO1＝AA／90＝52D は一旦N2ガス下に乾固し少量のメタノールで溶解したのち，シリカゲル・プレート上に標準品と rodloqutogrqphy 共に展開し（solventl chlorofom：MeOH：AA／ 90：5：1），標準品に一致したradioactiveなパ図3 Radiometricas＄ay（RMA）法による血小板産生12−HETEの測定ンドをシンチレーションバイアル中にけずりとり， d− 6一 0。1m旦の10mM還元型グルタチオンおよび14C− 0．1醜，Assay buffer O．1m￡を加えて，2時問イ AA （o．125μci）を加えて37℃で5分間インキュンキュベーションし，遊離の沮一TXB2をチャコベーションしたのち13μ旦のINHCLを加えてールで吸着分離し上清を声ウントした。反応を停止，酢酸エチルで2度抽出した。一旦N2 ガス下に乾固したのち，少量のメタノールで溶解 6keto−PGF1￠のRIA＝既述の方法に準じた、わ。・測定サンプルはPPP し標準品といっしょにシリカゲル・プレート上に O．5mΩより酢酸エチルで抽出し，最終的にAssay 展開した（solvent；chloroforml methanol：酢酸／ bUfferに溶解した。Assay systemはTXB2とほ 90：5：1）。標準品に一致したradioactiveなパンぼ同様であるが，抗6keto−PGRα（10．000cpm）ド（14C−12HETE）をけずりとり，cpmをカウを使用しだ。ントしcytosolの蛋白量で補正し，産生量とした薬品：（蛋白量の測庫にはLowry法を使用した）。溶媒とその他の薬品は市販の特級品を用い，血小板凝集能測定： 3H−TXB2はNew England Nucleaτより，3H− 測定には京都第一科学製血小板凝集計（PA 6keto−PGFIαおよび14C−Arachido皿icacidは 3210）をもちいたQ250超のPRPに，凝集惹起物質として50倍希釈コラーゲン液50μ皿を加えた。 Amershamより購入した。抗6keto−PGF1αウサギ血清および抗TXB，ウサギ血清はDr．Tai 血小板凝集能は，最大凝集（％）と最大凝集までより恵与された。の時間（min）とで検討した。凝集後のPRPはた〔結．果〕だちに一20℃へ冷却し，TXB2RIA用の検体と・したo 好中球産生PGsおよびLTB4： TXB2のRIA＝コント・一ルの産生量を100％ヶして比較した。既述の方法に従っておこなったD。簡単に述べ SLE患児では，図4に示すごとく，PGD2， P ると，検体（PRP）をpH3．0へ酸性化し，酢酸、エチルで2度抽出したのち一旦乾固し，Assay GE2，PGF2α共にステロイド治療中患児で117， b㎡fer（0．9％Nac1およびq4％bovinerglobu− 児で85，35，81％と低値を示した。JRA患児に 1in含有50mMsodium phosphate’buffer，pH7．4）おいてアスピリン（acetyl salitylic acid；ASA〉投に溶解して測定サンプルとした。サソプルもしく与児はPGD2，PGE2，PGF亟共コント・一ル 139，171％と高値を示し，逆にステロイド非投与は標準液0．1m旦に，抗TXB2ウサギ血清0．1m旦よりも低値を示し，ASA非投与児ではPGE2が（最終希釈1120。000x），3H−丁琴B2（10・000cpm） 1168％と高値を示した以外はコント目一ルと差が図4 RMA法によ’る一白血球産生㎜ PGD2。E2，F％ o ） σ●● ωF も召 O 舅＞ oっ一一一一㊤ユ Oユ舅︾ ωF 」37一いO − は使用していない。筐 ● O （民燗呂﹂︵k︶ m ポ㎜一 ■O ● テロイド，及び非ステロイド系抗炎症剤一アスピリンの投与中。open circleはス一〇している。SLEのclosed circleはプレドニンを，JRAのclosed circleは ● 一〇こないコントロールを100％として表現︵駅︶ −．N∩ 測定はコントロールの検体とペァでおなかった。 LTB4に関しては，図5に示すごとく，SLE でステロイド使用，非使用にかかわらずコントロールの35％および34．8％と極めて低い値を示した。．JRAにおいてもASA投与者で32％，24％と低値ールと差がなかった。％とした時SLEで91％（ステロイド投与）・およ oα 一一 ”“ 卿O 図6に示すごとく，産生量はコントロールを100 1 ”、血小板産生12−HE1’E＝ざ一であった。ただし，ASA非投与児ではコントロ（駅）一ロ一び82％（ステ巨イド非投与）とやや低値を，JRA、、はASA投与児で72％および39％と低値を示した。 ●o 血小板凝集能：コラーゲン50倍希釈液による最大凝集率を図7 Aに示した。コントロールは1例をのぞいて100 ％の凝集を示したが，SLEでは軽度の凝集抑制がみとめられたQ JRAではASA使用児で著明な抑制をみとめたが，ASA非使用児では抑制をみとめなかった。 ω ‘」「一フコ「『1 コ》図5’ MAによる白血球産生LTB4 0pen，closed circleは図4と同じ。最大凝集までの時間に関してもほぽ同様の結果を得た（図7B）。 200 血小板産生TXB2：図8に示すごとく，コントロール群の16．41土 9．47ng／m旦・PRP・pl105に比べて，SLEでは 0．58ng／m旦・PRP・pl105ときわめて低値を，限界以下であったQ PPP中6ke量←一PGF1α濃度：図9に示すごとく，コントロール群では，1，15 U﹄■］＝−製 JRAにおいてもASAの使用の有無にかかわらず低値を示し，特にASA投与中の患児では検量（膿︶ステ巨イドの非使用・使用にかかわらず，1．49， m ±0，08ng／m旦・PPPであったが，SLEでは0．88 および0。87㎎ノm旦とやや低値を示し，JRAでは ASA使用児は0，71および1．44n副mΩ，ASA非使用児では0，80㎎／m犯であった。ては，白血球PGD2，PGE2，PGF2αの産生は共に低値であり，治療中の患児では逆に高値を示した。ステ・イドがphospho lipase A2の阻害物一38一 ωF ステロイド治療をしていないSLE患児におい劣︶〔考案〕図6 RMAによる血小板産生12−HETE Open，closed circleは図4と同じ。 O● OΩδ ﹂召テ目イド潰療中の患児で高値を示した理由は明確 ωF 質を誘導する作用を有することを考慮すると，ス O ω ∩OZ、﹃ ω 3 名 ZO一﹂，くO国匡O㊤く o 5 o ︵￠一∈︶］＝一﹂．（A）最大凝集率（％）（B）最大凝集までの（ビ時間を示す。Open，clos♀d circleは図4と同じ。）㈱ O● 図7 Col Iagen50倍希釈液による血小板の凝集 LoD 8 ω L （B） …l F… 召ない。JRAの3例のうち2例は，cyclooxygenase の特異的阻害剤であるASAを服用中であり，この2例に関しては，PGD2，PGE2PGF2α共にでないが，PGD2，PGE2は共にヘルパーT−ce11 機能を抑制し，サプレッサーT−ceII機能を活性化するとの報告があり3，1疾患の活性期にPG ではなく，薬剤として，かなりの大量を長期間服 E2PGD2産生そのものの産生低下がおこり，回用しても好中球内の酵素活性を完全に抑制できな復期には産生が増加するとの可能性も否定はできいことカミ明らカ・となったo 産生は低下していた。しかしながら，完全な抑制 O δ一﹂o氏18皇o 10 Nρ。×↑ O ● O 8 冊し召 C。1、ag，n刺激後のPRP中TXB2をRIA獺」定・図9 ω岳 OOZ↓ ﹂召 ω岳 OOZ↓ 図8 血小板産生TXB2 ● 0● O O QりO 20 ㎜︵・っ葦§一．f。︻＼g︶︵ ∩匡広 Hε 一．O＼Oα ︶・注o PPP中6keto−PGF1αの濃度をRIAで測定 Open，closed circleは図4と同じ。 0pen，closedcircleは図4と同じ。一39一 SLEでは，ステロイド治療，非治療にかかわていた。TXA2のコラーゲン凝集における重要らず，LTB、産生は極端に低い値を示した。前述r 性をうらづけるものであるQ のごとくLTB4はサプレッサーT7cell機能を充進させて抗体産生に対しては抑制する方向に働くと考えられており4〉，LTB4の産生低下がB−cell’ の機能の充進に関与し．ている可能性はおおいに考 § 文献 1）Blase，R．M。，Grayson，」．and Steinberg， A．L，l Increased Immunoglobulin−Secret‡ng ce− えられる。JRAにおいてもASA投与児でLTB4 11s in the b1Qod of』patients with active Syste− の産生は低下していた。ASAは5−lip6xygenase mic lupus6rythematosus．Amer，」．Med。，69：を抑制することはなく，通常はcyclooxyg6nas6 345−350， 1980．を抑制するために，相対的に1ipoxygenaseの活性を上昇させると考えられており，LTB4の産生低下はASAの効果とは考えにくく，病態そのものに関連していると考えるのが妥当と思われるが，この点に関しては更に症例をふやして検討する必 2）4elinek，D，F．，Thompson，P，A。and Li． 2）Jelinek，D．F．，Thompson，P，A，and Li， psky，P．E．l Regulation of human B−cell Ac− tivation by pros七aglandin E2．J，Clin。Invesfl 75＝1339−1349， 1985． 3） Rocklin，R．E．，Thistle，L and Audera− 要がある。 C、：Decreased se草sitivity of atopic血ononu− 12−HETEは主に血小板で産生され，白血球お’ clear cells to prostaglan〔1in E2 （PGE2）and よび血管内皮細胞に対する強力な化学遊走惹起物 prostεしglandin D2（PGD2）．J．Immuno1．，135：質であることが知られている⑳。即ち，血管炎の発症と進行に関与した炎症のメディヰーターであり，TXA2と共に血管炎発症の機構に重要な役 2033−2039，1985， 4） Atlum，D。and Goo（1win，」．S．：Control of polyclonal immunoglobulin production fr一一〇m hum＆n lymphocytes by Leukotrienes：Le− 割をはたしている可能性があるため，SLEでは ukotriene B4induces cell from resting Human その動向が注目される。ところがコントロールに OKT（一）T−cells，J．Clin．Invest，，74：1444−1450，比べて，非ステロイド投与児でも産生の増加は認められなかった。病気の活動性のみならず，時期にも依存することが考えられ，経過をおっての検討が必要であると思われた。血小板産生TXB2に 1984． 5）HafstrOm，L，Palmblad，」．and et al： Leukotriene B4−A・stereospecific stimemulation for release of lysosomal enzymes from neu− trophils，FEBs letters，130：146−148，1981．関しても同様であり，SLEでは低値を示した。 6）Chang，W．C．，Nakao，J，and et a1：Ef− PPP中の6keto−PGF1αに関しても，SLEで fects of re（1uce（191utathione onr he 12−1ipoxyg− はコントロールに比しやや低い値を示しているが， enase pathwαys in rat platelets．Biochen．J．， TXB2の産生低下の方がより著明であった。血栓および血管炎の発生にはTXA、／PG12比の上昇が関与するとする所謂“陰陽セオリー”とは一 202：221−376，1982． 7）浜崎雄平，市丸智浩，他：川崎病（MCLS）に対するアセチルサリチル酸治療の再検討；とくにアラキドン酸代謝面より（実験の部）．小児学会誌（acce．致しない9）。しかしながら，本研究でも示された pted）．ごとく，血小板cyclooxygenaseは白血球に比し 8） Nakao，J．，Ooyama，H。εlnd e七al：Ca1．て容易に抑制され，病歴上は明確ではなかったが， cium dependency of aortic sエnooth muscle ce− 何らかの抗炎症剤の服用による一過性の影響も完 11migration induced by12−L−hydroxy−5，8，10， 14−eicosa tetra enoic acid．Atherosclerosis．46：全には否定できない。イ血小板凝集は，SLEでステ・イド治療の有無にかかわらず軽度抑制，ASA治療中のJRAでは著明な抑制をうけ，TXB2の産生量と平行し 309−319，1983． 9）Moncada，S．and Vane，」．R．：Pharma− cology and endogenons rQles of prostaglandin endoperoxides，thromboxane A2and prostacy− clin』PharmacoL Rev．，30＝293−331，1979．＿40＿》