in vitro システムにおける細胞増殖・細胞生存分析 Tecan 製 Infinite

アプリケーション・ノート
in vitro システムにおける細胞増殖・細胞生存分析
Tecan 製 Infinite® 200 による細胞培養法
緒言
細胞増殖・生存アッセイは、研究所、ライフサイエンス企業、製薬
業界で広く行われている。in vitroシステムを利用する研究所では、
細胞ベースアプリケーションの細胞生存マーカー評価を必ず実施
している。
細胞生存率の測定法で最も広く利用されているのは、細胞の還元
能に基づき、比色反応を利用して評価を行うMTTアッセイであろう。
生存細胞内では、細胞質酵素とミトコンドリア内酵素（コハク酸デヒ
ドロゲナーゼ）の作用により、黄色のテトラゾリウム塩MTT（3-(4,5ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）
が減少し、紫色の不溶性ホルマザンが生成する。溶解剤（ジメチル
スルホキシド（DMSO）かイソプロパノールのいずれかを使用する
ことが多い）を添加して水不溶性ホルマザン生成物を溶解し、着色
溶液を生成する。この溶液の565nmの吸光度を測定することによ
り、ホルマザン生成物の定量測定を行うことができる[1]。しかしな
がら、生成したホルマザンが細胞毒性を有する場合があり、偽陽
性反応を示すケースが見られることから、MTTアッセイによる生存
率測定の結果に誤りが生じる可能性があることが報告されている
[2]。
MTT の代替物質となるのが、MTS（3-(4,5-ジメチルチアゾール2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)2H-テトラゾリウム）である。MTSは、フェナジンメトスルフェート
(PMS)の存在下で490nmに吸収ピークを持つ水溶性ホルマザン
を生成する。
MTSアッセイは、MTS試薬の細胞内還元効率がMTT試薬よりも
高く、また最終生成物が水溶性であり、MTTアッセイで利用され
る不溶性ホルマザンよりも細胞毒性が小さい点でMTTアッセイよ
®
りも優れている[2]。Promega社が「CellTiter 96 AQueous One
Solution Cell Proliferation Assay」の商標でMTSアッセイシステ
ムを市販しており、これを利用することができる[3]。
MTT
MTS（CellTiter 96 AQueous）
レサズリン（CellTiterBlue）
図 1：MTT、MTS、レサズリンの分子構造 [6]
1
アプリケーション・ノート
●
PKI (Sigma Aldrich, Austria)
●
FBS (PAA Laboratories, Austria)
●
MTT (Sigma Aldrich, Austria)
●
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation
Assay (Promega, USA)
●
CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, USA)
試料調製
パート1‐細胞希釈液の調製：
F. Berr教授とT. Kiesslich博士（パラケルスス医科大学・SALK第
一内科）のご厚意により、ヒト胆管癌細胞（CCLP-1）の提供を受け、
L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Pen/Strep、HEPES、10％加
熱不活性化ウシ胎仔血清（FBS）を添加した標準培地（DMEM）を
使用し、37℃、CO2濃度7.5%の環境で培養した[7]。下図に示すプ
レート配置を用いて、１ウェルあたり50 µl の培地体積を備えた384
ウェルプレート上で、22段階の細胞希釈液を調製した。
2963
1975
1317
878
585
390
260
173
116
77
51
34
23
15
10
7
5
3
2
1975
1317
878
585
390
260
173
116
77
51
34
23
15
10
7
5
3
2
1317
878
585
390
260
173
116
77
51
34
23
15
10
7
5
3
2
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1975
8
4444
7
2963
6
2963
5
6667
4
4444
3
4444
10000
2
10000
1
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
6667
このアプリケーションノートには代表的な測定データのみを記載し
ている。したがってこのデータは機器の仕様を示すものではない。
DPBS (Sigma Aldrich, Austria)
6667
パート2‐PKI希釈液の調製：
次に、市販のプロテインキナーゼ阻害剤（PKI）の濃度を変えて細
胞の処理を行った。MTT、MTS、レサズリンを用いて細胞生存率
の低下を評価した。
●
10000
パート1‐細胞希釈液の調製：
実験ではまず、細胞希釈液を調製し、3種類のアッセイシステムを
用いて測定を行った。各色素に対して理論上の検出限界（１ウェル
あたりの細胞数）を計算した。
DMEM (PAA Laboratories, Austria)
MTT
上記3種類のアッセイシステムの比較には、Tecan製Infinite M200
Quad4 MonochromatorsTMベースのマルチ検出モードリーダーを
使用した。
●
CellTiter
AQ
本アプリケーションノートでは、上記3種類のアッセイシステム
®
（MTTアッセイ、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell
®
Proliferation Assay（MTS）、CellTiter-Blue Cell Viability Assay
（レサズリン））を採用し、ヒト胆管癌細胞株CCLP-1を用いた比較
を行った。
試薬
CellTiter
Blue
同じく酸化還元ベースアッセイとして開発されたのが、蛍光色素レ
サズリン（7-ヒドロキシ-3H-フェノキサジン-3-オン10-オキシド）を利
用する方法である。レサズリンは、培養液中の細胞に直接添加す
ることができる酸化還元指示薬である。この蛍光色素は生細胞に
よって還元され、酸化型（レサズリン）である紺青色から、還元型で
ある蛍光赤色（レゾルフィン；570 nmEx；590 nmEm）に変化する。死
細胞はすぐに代謝機能およびレサズリン還元能を失い、したがっ
て蛍光シグナルを発しなくなることから、このシステムにより細胞生
存性のみを測定することができる。レサズリンは当初、細菌研究に
利用されていたが[4]、現在では真核細胞ベースアプリケーション
®
用としてもいくつかの商標名（「AlamarBlue assay」、「Resazurin
Fluorometric Cell Viability Assay Kit」など）で市販されている[5]。
Promega社では「CellTiter-Blue® Cell Viability Assay」の商標名
で、この技術を提供している[3]。
=H2O
材料および方法
機器
●
アッセイの開始に先立ち、細胞を一晩培養した。
Tecan製Quad4 Monochromator搭載 Infinite M200（Tecan
Austria（オーストリア）製）。
吸光とFI下方測定モジュールを装備した。
マイクロプレート
●
図 2：パート 1‐細胞希釈液調製用プレート配置図
®
Greiner 384 well black with transparent bottom, µClear;
medium volume 50 µl (Greiner Bio-One, Germany)
MTTアッセイ手順：
- 各ウェルに2.5 mg/ml MTT溶液10 µlを添加した。
- CO2濃度7.5％、37℃で45分間、細胞を培養した。
- 浮遊物を吸引し、各ウェルで生成したホルマザンをそれぞれイ
ソプロパノール50µlで希釈した。
- 表1にまとめた設定値を用いて、マイクロプレートの測定を行っ
た。
2
アプリケーション・ノート
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay手
順：
- 添付文書[3]の説明に従い、各ウェルにCellTiter AQ 10 µlを添
加した。
- CO2濃度7.5％、37℃で3時間、細胞を培養した。
- 後述の設定値を用いてマイクロプレートの測定を行った。
CellTiter-Blue Cell Viability Assay手順：
- 添付文書[3]の説明に従い、各ウェルにCellTiter Blue 10 µlを
添加した。
- CO2濃度7.5％、37℃で3時間、細胞を培養した。
- 後述の設定値を用いてマイクロプレートの測定を行った。
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assayと
CellTiter-Blue Cell Viability Assayについては、a) 標準的な細胞
培養用CO2インキュベーター、またはb) 37℃に加熱したInfinite
M200中で3時間の培養を行った。これは、アッセイ培養における
Infinite M200の加熱機能の効果を確認するために実施したもので
ある。
パート2‐PKI希釈液の調製：
1ウェルあたり3240個のCCLP-1細胞を384ウェルプレートに撒き、
一晩接着させた。浮遊物を除去したのち、0％FBSと各種濃度
（µM）のPKIを含有するDMEM 50µlを各ウェルに分注した（図3）。
これをCO2濃度7.5％、37℃で一晩培養した。
0,0023
0,0034
0,0051
0,0076
0,0114
0,0171
0,0257
0,0385
0,0578
0,0867
control
0,1301
0,1951
0,2926
control
control
control
0,0023
0,0023
0,0034
0,0034
0,0051
0,0051
0,0076
0,0076
0,0114
0,0114
0,0171
0,0171
0,0257
0,0257
0,0385
0,0385
0,0578
0,0578
0,0867
0,0867
control
control
0,1301
0,1301
0,1951
0,1951
0,2926
0,4390
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
0,2926
0,4390
0,6584
8
0,4390
0,6584
0,9877
7
0,6584
0,9877
1,4815
6
0,9877
1,4815
2,2222
5
1,4815
2,2222
3,3333
4
2,2222
3,3333
5,0000
3
3,3333
5,0000
2
5,0000
CellTiter
Blue
CellTiter
AQ
MTT
1
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
=H2O
図 3：パート 2‐PKI 希釈液の調製用プレート配置図
Measurement parameter
Instrument settings
Plates
[GRE384fb.pdfx]
Shaking (prior to read)
20 sec; 1 mm amplitude; orbital
Mode
Absorbance
Wavelength
490 nm
Bandwidth
9 nm
Number of flashes
25
Settle time
0 ms
表 2：CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 用測定
パラメータと機器設定値
Measurement parameter
Instrument settings
Plates
[GRE384fb.pdfx]
Shaking (prior to read)
20 sec; 1 mm amplitude; orbital
Mode
Fluorescence intensity bottom
Excitation wavelength
560 nm
Excitation bandwidth
9 nm
Emission wavelength
590 nm
Emission bandwidth
20 nm
Gain
Optimal
Number of flashes
25
Integration time
20 µs
Lag time
0 µs
Settle time
0 ms
表 3：CellTiter-Blue Cell Viability Assay 用測定パラメータと機器設定値
データ解析
パート1‐細胞希釈液の調製：
異常値を除外するためにスミルノフグラブス検定を行い、未処理デ
ータの質を評価した。各希釈液の平均値を算出し、平均ブランク値
を差し引いて補正した。ガウス分布により、エラーバーを設定した
[8]。数値は、個々の４ウェルの補正平均値を示している。下式を用
いて、MTTアッセイとCellTiter 96 AQueous One Solution Cell
Proliferation Assayの理論上の検出限界を計算した。
Sensitivity (OD) = 3 * SD (blank) + average (blank)
測定の設定
Measurement parameter
Instrument settings
Plates
[GRE384fb.pdfx]
Shaking (prior to read)
180 sec; 1 mm amplitude; orbital
Mode
Absorbance
Wavelength
565 nm
Bandwidth
9 nm
Number of flashes
25
Settle time
0 ms
表 1：Infinite M200 での MTT アッセイ用測定パラメータと機器設定値
測定結果として得られたOD値を使用し、各トレンドライン曲線
（y=kx+d）の式を用いて対応する濃度（１ウェルあたりの細胞数）を
計算した。また下式を用いて、CellTiter-Blue Cell Viability Assay
の理論上の検出限界を計算した。
Sensitivity (cells/well) =
3 * SD (blank) * 10000
(average sample – average blank)
試料の平均値については、最初の希釈液（１ウェルあたり細胞
10000個）に対する測定結果を使用した。
3
アプリケーション・ノート
結果・考察
43500
CellTiter Blue - incubation in Infinite M200
CellTiter Blue - incubation in common incubator
38500
33500
fluorescence (RFU)
パート2‐PKI希釈液の調製：
異常値を除外するためにスミルノフグラブス検定を行い、未処理デ
ータの質を評価した。各希釈液の平均値を算出し、平均ブランク値
を差し引いて補正した。この数値には、未処理対照試料の平均値
との関連性が見られた。ガウス分布により各エラーバーを設定した
[8]。数値は、個々の４ウェルの補正平均値を示している。
28500
23500
18500
13500
8500
パート1‐細胞希釈液：
3500
-1500
MTT assay
0,9000
1
10
100
1000
10000
100000
num ber of cells
0,8000
図 6：細胞希釈液の調製‐CellTiter-Blue Cell Viability Assay
0,7000
OD (565 nm)
0,6000
レサズリンベース CellTiter-Blue Cell Viability Assay は、本研究
で試験を行った 3 種類の方法の中では、群を抜いて感度の優れた
測定法である。標準偏差は極めて小さく、そのため標準的なインキ
ュベーターで培養した場合の検出限界は１ウェルあたり細胞 14 個
と極めて小さな値となっている。Infinite M200 内でアッセイ培養を
実施した場合の検出限界も、インキュベーターで培養した場合とさ
ほど大きくは変わらず、１ウェルあたり細胞 44 個となっている。
0,5000
0,4000
0,3000
0,2000
0,1000
0,0000
-0,1000
1
10
100
1000
10000
100000
num ber of cells
パート2‐PKI希釈液：
図 4：細胞希釈液‐MTT アッセイ
図 4 に、MTT アッセイによる細胞希釈液の測定曲線を示す。理論
上の検出限界の計算値は、１ウェルあたり細胞 475 個となった。
CellTiter Aq - incubation in Infinite M200
CellTiter Aq - incubation in common incubator
1,7
1,5
図 7 に示すデータは、PKI が CCLP-1 細胞にもたらす細胞毒性効
果をはっきりと示している。最小有効濃度には、アッセイ法によりわ
ずかな差が生じている。すなわち、MTT アッセイの最小有効 PKI
濃度（未処理対照群は 92.86％‐細胞の 7.14％に影響）が 0.658
µM であるのに対し、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell
Proliferation Assay では、PKI 濃度約 0.44 µM で同じ効果が現れ
ている。両アッセイとも、PKI 濃度 5µM で最大の細胞毒性効果を
誘発し、未処理対照細胞は約 34％となっている（細胞の 66％が
影響を受けている）。
OD (492 nm)
1,3
1,1
0,9
0,7
0,5
0,3
0,1
-0,1
CCLP-1 細胞の細胞毒性に関する 3 種類の細胞生存アッセイの
性能を評価するため、アッセイ開始の 20 時間前に、各種濃度のプ
ロテインキナーゼ阻害剤を添加した。過去に行った予備実験結果
から、プロテインキナーゼ阻害剤が主なシグナル変換経路を阻害
し、CCLP-1 細胞の細胞毒性を誘発することが明らかになっている
（Kiesslich / Berr et al による論文作成中）。
1
10
100
1000
10000
100000
num ber of cells
図 5：細胞希釈液‐CellTiter 96 AQueous One Solution Cell
Proliferation Assay
MTS ベース CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation
Assay による希釈液の測定曲線の誤差が、特に低濃度領域で小
さくなっていることが分かる。したがって、検出限界は MTT アッセ
イよりも大幅に小さな値となる。標準的なインキュベーター内で 3
時間のアッセイ培養を実施した場合、検出限界は１ウェルあたり細
胞約 143 個となる。一方、インキュベートした Infinite M200 内で
培養した場合には感度がやや低下し、検出限界は１ウェルあたり
細胞 250 個となる。
CellTiter-Blue Cell Viability Assay でも、ほぼ同じような結果が得
られた。この場合も、最小有効 PKI 濃度は約 0.44 µM となり、PKI
濃度 5µM で細胞毒性が最大に達し、未処理対照細胞は約 30％
となっている。
4
アプリケーション・ノート
測定結果から、Infinite M200 は上記アッセイシステム用機器とし
て理想的な機器であることが明らかとなった。Infinite M200 は、感
度と均一性に優れているだけではなく、加熱機能を備えているため、
データの質を損ねることなく、全アッセイを Infinite M200 内部で実
施することができる。
MTT - dose response curve
120,00
% control
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0,001
0,01
0,1
1
10
Promega 社の CellTiter-Blue Cell Viability Assay は、本研究で
対照としたアッセイ法の中では、群を抜いて優れた感度を備えてい
た。次いで CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation
Assay が高い感度を示した。MTT アッセイには、他の 2 種類のア
ッセイ法と比較するといくつかの欠点が見られるものの、Infinite
M200 マルチ検出モードリーダーで細胞数と細胞毒性の測定を行
うには充分な性能を備えている。
PKI (µM)
CellTiter AQ - dose response curve
参考文献
120,00
100,00
[1]
Mosmann T (1983). Rapid colorimetric assay for cellular
growth and survival: application to proliferation and
cytotoxicity assays. Journal of immunological methods
65 (1-2): 55–63.
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207–12.
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Hallinan FJ. (1943). Pyrex Suspensions in Turbidimetric
and Colorimetric Determinations-Standards of
Comparison for Bacterial Suspensions and in the
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[3H]thymidine incorporation assay. J Immunol Methods.
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Pharmacological Inhibition. Stockholm, Sweden, 12-16
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Oberdanner et al. (2005). Photodynamic treatment with
fractionated light decreases production of reactive
oxygen species and cytotoxicity in vitro via regeneration
of glutathione. Photochem. Photobiol. 81(3), 609-613
% control
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0,001
0,01
0,1
1
10
PKI (µM)
CellTiter Blue - dose response curve
120,00
100,00
% control
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0,001
0,01
0,1
1
10
PKI (µM)
図 7：PKI 用量反応曲線
結論
細胞増殖・細胞生存アッセイは、細胞数と細胞毒性効果を評価す
る際に一般的に使用されている。本研究では、MTT アッセイ、
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、
CellTiter-Blue Cell Viability Assay のそれぞれに関する Infinite
M200 の性能評価を行った。
5
アプリケーション・ノート
謝辞
略語の一覧
CCLP-1
ヒト胆管癌細胞株
CK-2
カゼインキナーゼ 2
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO
ジメチルスルホキシド
DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
FBS
ウシ胎仔血清
HEPES
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタ
ンスルホン酸
MTS
(3-(4,5- ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カル
ボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)2H-テトラゾリウム),
MTT
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェ
ニルテトラゾリウムブロミド
PKI
プロテインキナーゼ阻害剤
PMS
フェナジンメトサルフェート
細胞培養と溶液調製に際してご協力いただいた、Frieder Berr教
授（パラケルスス医科大学・SALK第一内科）とTobias Kiesslich博
士（パラケルスス医科大学・SALK第一内科）に対し、深く御礼申し
上げます。
Groedig, Austria 2009 年 7 月
Tecan、Infiniteは主要諸国におけるTecan Group Ltd.（スイス、Männedorf）の登録商標です。quad 4 monochromatorsは同商標です。
Greiner is a trademark of Greiner-Bio-One, Germany.
CellTiter 96 and CellTiter Blue are registered trademarks of Promega Corporation, USA.
Alamar Blue is a registered trademark of Invitrogen Corporation, USA.
Austria T +43 62 46 89 33 Belgium T +32 15 42 13 19 China T +32 15 42 13 19 Denmark +45 70 23 44 50 France +33 4 72 76 04 80
Germany +49 79 51 94 170 Italy +39 02 215 21 28 Japan +81 44 556 73 11 Netherlands +31 18 34 48 174 Portugal +351 21 000 82 16
Singapore +65 644 41 886 Spain +34 93 490 01 74 Sweden +46 31 75 44 000 Switzerland +41 44 922 89 22 UK +44 118 9300 300
USA +1 919 361 5200 ROW +43 62 46 89 33
www.tecan.com
396 065J V1.0, 08-2009
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6

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