「第一回質量分析の定量セミナー」報告

「第一回
質量分析の定量セミナー」報告
日時：２０１４年６月３日（火）１４：００～１５：３０
場所：生物科学研究棟
３階大セミナー室（S３１１）
講師：（株）島津製作所
山田真希先生
内容：
「高速トリプル四重極型質量分析計（LCMS-8040)による脂質メディエーターおよびリン脂質の一
斉分析手法の開発）
・脂質メディエーターについて
・脂質メディエーター一斉分析方法の開発
・高速 MS/MS スキャンによるリン脂質分析
・LCMS-8050 のご紹介
セミナー参加者：２１名（島津関係者：２名）
主任研究員室：４室
環境資源科学研究センター：１チーム
脳科学総合研究センター：１ユニット
グローバル研究クラスタ：１チーム、１ユニット
グローバル研究クラスタの教育セミナー第 2 弾として、3 回シリーズで質量分析の定量測定方法を中
心に講演を行った。第 1 回は LCMS-8040 を用いた脂質メディエーターの一斉分析方法の開発を中心に
興味深いお話があった。また、参加者から、多くの質問があり、質疑応答も 20 分程度にわたり行われ
た。質問は、試料はどのくらいあればよいかとか、回収率やイオンサプレッション、トランジションの
汲み方など実際の実験に即したものが多かった。講師からは、重水素ラベルした内部標準の回収率と、
前処理後に標準品を加えた回収率から、前処理の回収率とイオンサプレッションを区別して原因を解明
していると言った、ノウハウについてもご回答いただいた。
終了予定時間が３０分伸び、１５：３０に終了しました。
アンケート結果（回答者：１６名）
教育セミナーの内容は？
難しかった：７名、
適切であった：９名、
易しかった：０名
感想は？（複数回答有）
・MRM の原理、実際の応用・測定について理解ができた。
・LC-MS による脂質メディエーターの分析について、基礎的なことから応用的な内容まで分かり易
く説明されており、大変参考になった。
・初めの方の装置の原理、スペックの意味をもう少し説明して欲しかった。
・質量分析法による定量の有用性と問題点について触れることができた。
・LCMS-8040/8050 の他のアプリケーションも紹介して欲しかった。
・Triple-Q の原理について良く分かった。
・紹介された装置で QI を Scan に使うという発想が面白い。
・脂質以外にも問題無く測定可能か知りたい。
・脂質メディエーターについても学べて良かった。
・極性の切替が早い所が良いと思った。
・重水素体を内部標準として用いることが分かり勉強になった。
・定量が一般的な時代が来た事がうれしい。
・専門用語が多く、話の内容がほぼ分からなかった。
・基礎的な知識が乏しく、分からない用語が多かった。
・毛色が違って良かった。
・質疑応答が後ろの方で聞き取り辛かった。
以上
グローバル研究クラスタ
セミナー
３回シリーズ
第一回質量分析の定量セミナー
今回の３回シリーズのセミナーでは、生体分子の質量分析による定
量測定の方法を講演いたします。
生物系の質量分析では、どのような成分があるかを調べる定性的な
分析から、どのくらいあるかを調べる定量的な分析へと興味が移りつつ
あります。また、それに合わせて、装置や手法も日進月歩で進んでおり、
今まで調べることが出来なかったような微量成分や、多種類の成分の
一斉分析なども行うことが出来るようになってきています。今回、第一
回では講師に島津製作所の山田真希先生をお迎えして、リピドミクスを
例に高速MRMを中心に定量の質量分析法についてご講演いただきま
す。ご興味のある方、お時間の許す方は是非ご参加ください。
なお、事前に人数把握のため、下記の渡辺まで、ご連絡ください。
日時
場所
講師
題名
2014年6月3日（火）14：00～15：00
生物科学研究棟 3階大セミナー室（S311）
株式会社島津製作所山田真希先生
「高速トリプル四重極型質量分析計（LCMS-8040)による脂質
メディエーターおよびリン脂質の一斉分析手法の開発」
（日本語での講演： Japanese only ）
主催
連絡先
グローバル研究クラスタ連携支援ユニット
連携支援ユニット渡辺（[email protected]）
今後の予定
6月24日（火）：第二回
Thermo Fisher Scientific （株）
7月10日（木）：第三回
（株） AB SCIEX
高速トリプル四重極型質量分析計
LCMS-8040による脂質メディエーター
およびリン脂質の一斉分析法の開発
2014年6月3日（火）
（株）島津製作所
分析計測事業部グローバルアプリケーション開発センター
山田真希（やまだまさき）
脂質メディエーター
• 生理活性を示す生体内脂質代謝物の総称
・脂肪酸代謝物
・リン脂質代謝物
・スフィンゴ脂質
・コレステロール代謝物
・…etc.
• 脂質代謝酵素により産生
・一つの前駆体から異なる生理活性を示す代謝物群が生じる
• 受容体のリガンドとして機能する
・１リガンド（の機能）⇔１受容体（の機能）
アラキドン酸カスケード
Shimizu et.al., Annu. Rev. Pharm. Toxic. 2009
トリプル四重極型質量分析計（Triple-Q）
MRM (multiple reaction monitoring) 法
or SRM (selected reaction monitoring) 法
・トリプル四重極型MSを用いた高感度定量用の検出モード
・クロマトグラフィーと組み合わせて使用
例）12(S)-HETE（分子量320）を検出する場合
Inert gas
HPLC
ESI
MS1
Collision Cell
（イオン化）（m/z = 319 を選択する（衝突誘起解離）
フィルタとして固定）
Detector
MS2
（m/z = 179 を選択する
フィルタとして固定）
5
MRMの利点
PDA (UV)
SPD-M20A
Single-Q
LCMS-2020
20 ppm
UV
Triple-Q
LCMS-8030
10 ppb
SIM
感度低く，バックグラウンドも高い
低
高感度だが，バックグラウンドが高い
選択性･感度
10 ppb
MRM
バックグラウンドを取り除き，高い
S/Nで微量定量が可能
高
トリプル四重極型LC/MS/MS: LCMS-8040
スキャンスピード:
極性切替速度:
Pause time (minimum):
最大SRM数:
高速
15,000 u/sec
15 msec
1 msec
555 ch/sec
MRMモードの動作
4種の化合物をPositiveモードとNegativeモードで検出する場合
Positive
Dwell time:
データ取り込み時間
Pause time:
⇒A
モード切替時間
Negative
Positive
Dwell
Dwell
Dwell
Dwell
Dwell
A
B
C
D
A
Pause
A⇒B
極性切替時間 B⇒C
C⇒D
Pause
Pause
Pause
A⇒B
Pause
351.10>271.10(-)
250000
200000
cps
1ミリ秒で電圧を切り替え、
15ミリ秒で極性を切り替え
安定に電圧を供給
Pause
8-iso PGE2
300000
LCMS-8040では、
極性切替時間 D⇒A
PGE2
150000
4秒
100000
50000
0
10.50 10.55 10.60 10.65 10.70 10.75 10.80 10.85 10.90 10.95 min
Time (min)
ピーク半値幅4秒のクロマトグラムでプロット
Ultra-High Speed
 UFsweeper® がイオンを効率よく sweeping（一掃）
q2 (コリジョンセル)
検出部
Q3
q2
コリジョンセル（衝突セル / 衝突室）
Q1とQ3の四重極ロッド間に配置された高周波イオンガイドのことでq2
を指す。加速したイオンを不活性ガスと衝突させると、その衝突エネル
ギーによってイオンが壊れるためにイオンの解離が起きるが、これを衝
突誘起解離（CID：collision-induced dissociation）という。
Q1
15分間サイクルでの一斉分析 2005 ver.
標準品5pgずつの
混合物の検出例
内部標準として 6-ketoPGF1a, TxB2, PGF2a,
PGE2, PGD2, PGB2,
LTB4, 5-HETE, 12-HETE,
15-HETE, PAF の重水素標
識化合物が利用可能
Kita et.al., Anal. Biochem. 2005
130成分の一斉分析 2013 ver.
LCMS-8040により脂質メディエーター標準品130成分を一斉分析
Int. (x 100000)
15-oxoEDE OEA
8.0
7.0
PEA
PGJ2
6.0
Cys-LTs
20-HETE HETEs
15-HEPE HEPEs
EET-EAs HDoHEs AEA
EETs
HODEs
DiHETEs DHETs
PAF
& LTB4
PGA2
5.0
8-iso-PGE2
4.0
3.0
2.0
tetranor tetranor PGEM
PGFM
tetranor PGDM
6-keto-PGF1a
20-OH-PGE2
PGF2a
PGE2
PGD2
Isoprostanes
AA
EPA
DHA
20-OH-PGF2a
1.0
0.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
min
150
50
0
6ketoPGF1a
13-14dh 15k tetnol PGF1b
13-14 dh15k tetnol PGF1a
13-14 dh15k tetnol PGE2
6-15 dk 13-14 dh PGF1a
8i15rPGF2a
8iPGF2a
TXB2
PGE3
8iPGF2b
8iPGF1b
5iPF2a
PGD3
PGF2a
8iPGE2
PGE2
15k PGF2a
PGD2
PGE1
PGD1
15k PGE2
1314dh-15k-PGF2a
5S6R15S-LXA4
1314dh-15k-PGE2
LTD4 pos
13-14dh 15k PGD2
LTC4 pos
LTE4 pos
11 trans LTC4 pos
11-trans LTE4 pos
PGA2
PGJ2
PGB2
17-18 DiHETE
5-15 DiHETE
6trans LTB4
LTB4
12epi LTB4
13-14 dh15k PGJ2 pos
14-15 DiHETE
56-DiHETE
14-15 DHET
12S-HHTrE
11-12 DHET
8-9 DHET
20 carboxy AA
13 HOTrE
18 HEPE
15deoxy-d1214-PGJ2
20 HETE
15 HEPE
18 HETE
17 HETE
12 HEPE
5 HEPE
16 HETE
9 HODE
13S HODE
15 HETE
13 oxoODE
16 HDoHE
11 HETE
9 oxoODE
13 HDoHE
8 HETE
10 HDoHE
14 HDoHE
15 HpETE
12 HETE
PAF
17 HDoHE
7 HDoHE
11 HDoHE
5 HETE
8 HDoHE
15 HETrE
12 HpETE
12 oxoETE
4 HDoHE
5 HpETE
5 oxoETE
15 HEDE
AEA pos1
5-6 EET pos
8-9 EET
PEA pos1
15-oxoEDE pos
Oleoyl EA pos1
pg/mg tissue
マウス脳の脂質メディエータープロフィル
brain
brain
250
PGD2
200
PGF2a
100
PGE2
メソッドパッケージ
LC/MS/MS Rapid
Toxicology
Screening System
LC/MS/MS Method
Package for
Lipid Mediators
LC/MS/MS Method
Package for Primary
Metabolites
12
高速スキャン時のピーク形状
• MS1の高速スキャン
・15000 u/sec (Q3MS)
・最高速でもピーク形状保っていて美しい
LCMS-8040によるMS/MSスキャンの例
Precursor ion scan (m/z 184 for PC)
1.25
1.00
0.75
Inten.(x100,000)
760.5
Speed: 0.4 sec/scan
3750 unit/sec
m/z 150 – 1500
1.75
Inten.(x10,000)
782.4
1.50
1.25
786.5
約4倍高速
1.00
0.75
0.50
0.50
0.25
0.25
834.5
0.00
250
500
750
0.00
780.0
785.0
1000
790.0 m/z
1250
m/z
Neutral loss scan (141 for PE)
2.5
2.0
Inten.(x10,000)
Inten.(x10,000)
716.6
792.6
0.12 sec/scan
10000 u/sec
m/z 400 - 1400
1.00
0.75
1.5
716.6
717.6
約10倍高速
0.50
1.0
0.25
0.5
0.00
840.5
638.7
715.0
0.0
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
720.0
1300
m/z
m/z
LCMS-8050:
Speed and Sensitivity Beyond Comparison
1. Best in Class Sensitivity
2. World Fastest Scanning Speed: 30,000 u /sec
3. World Fastest Polarity Switching Rate: 5 msec

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