トピックス 80 〔ビタミン 89 巻 鉄硫黄クラスター形成に関わる硫黄輸送システム 6XOIXU7UDQVSRUW6\VWHPIRUWKHIRUPDWLRQRILURQVXOIXUFOXVWHU 輸送タンパク質は，相反する 2 つの機能を担うこと トランスフェリンは，エンドサイトーシスによって細 が求められる．輸送タンパク質は，輸送すべき元素ま 胞内のベシクル内に封入される．次に ATP 駆動型プロ たは低分子化合物と特異的かつ安定に結合する仕組み トンポンプの作用によってベシクル内の pH は低下し を持たなくてはならない．その一方で，輸送タンパク て酸性となる．高校の化学で学ぶように，酸性条件下 質は目的地に到着した時，または受け渡しするタンパ では炭酸イオン（CO 32− ）は炭酸ガス（CO2）となるので ク質に遭遇した場合には，その荷物を放り出す機能を トランスフェリン内部で CO32− リガンドが崩落する． 持たなければならない．結合と放出は正反対の機能な その仕組みにより，強く結合していた鉄イオンが解離 ので，その切り換えには，何か特別な仕掛けが必要で されるのである．この仕掛け，見事と言うほかない． ある．輸送タンパク質は，どのようなメカニズムでこ その放出された鉄イオンは，鉄貯蔵タンパク質である の難題に対応するのか．精緻な触媒機構を持つ酵素と フェリチンに取り込まれる．運び屋の特性として，化 比べて，輸送タンパク質は地味なイメージを持たれが 学結合の巧みな利用とともにタンパク質構造のダイナ ちであるが，結合と放出のしくみを解明することは魅 ミックなコンフォメーション変化も重要である．トラ 力ある課題といえる． ンスフェリンも鉄結合状態と解離状態でその立体構造 強い結合と速やかな放出を体現している運び屋とし を大きく変化させることが知られている 1）． て，ほ乳類の血液中で鉄を輸送するトランスフェリン 近年，注目されているのは硫黄の運び手として機能 があげられる．トランスフェリンは鉄（Fe 3＋）との結合 するタンパク質たちである．タンパク質の電子授受に において，自身の Tyr，His，Asp 残基とともに炭酸イ 機能する鉄 - 硫黄クラスターには， ［2Fe-2S］型， ［4Fe- オン（CO32− ）を巻き込んで鉄 - 炭酸錯体として Fe3＋ を 4S］型などユニークな構造が存在しており，タンパク 1） 補足する ．ハードソフト酸塩基（HSAB）の経験則に 3＋ 2− 質に結合した鉄 - 硫黄クラスターは異なる酸化還元電 よれば，Fe と CO3 は固い酸と固い塩基なので，3 位を持つ．これらの硫黄原子は，アミノ酸の L-システ 価鉄と炭酸は強固で安定な結合体を形成できる（図 イン（L-Cys）に由来する．L-Cys から 2 価の硫黄を切り 3＋ 1）．Fe が中性の水にはほとんど溶けないことや，病 出すのは，システイン脱硫酵素（L-Cys desulfurase）の 原菌の感染成立にはホストの鉄を奪取することが必須 作用による．L-Cys から切り出される 2 価硫黄とは， の過程であることを考えると，トランスフェリンの使 つまり硫化水素イオン（HS−）のことである．これが細 命は極めて重要である．それでは，鉄イオンはどのよ 胞内に遊離されると極めて有毒なので，硫黄授受はタ うにして放出されるのか．鉄をしっかりと抱き込んだ ンパク質間での「直接的な S の授受プロセス」が存在す ると考えられてきた．システイン脱硫酵素と硫黄輸送 体が相互作用することは，輸送タンパク質を共存させ ると脱硫酵素の反応速度が高くなることからも支持さ れてきた 2）．システイン脱硫酵素はピリドキサールリ ン酸を補欠分子族として持つが，この補欠分子はタン パク質内部の奥底にある．また切り出した硫黄を酵素 の表面に運び出す可動性の高いループの存在も結晶構 造解析から考察されてきた．硫黄を受け取る運び屋の 側も可動性ループを持ち，その領域に含まれる L-Cys 残基が過硫化物（-S-SH）を形成すると考えられる．ルー プ構造の可動性が硫黄授受の鍵を握ることは重要な示 唆である．そのような動的な構造解析はどうアプロー チできるだろうか．可動性の高いループは，大抵の場 合ハッキリ見えないので，結晶構造解析では硫黄の授 図 1 トランスフェリンの Fe3＋捕獲 受の仕組みは明らかにできない． 2 号（2 月）2015〕 トピックス 81 Singh ら 3）は，硫黄の授受プロセスを分子レベルで 硫黄の授受能力を失ったアルキル化 SufE をつぎに作 解析する新たな手法として水素 - 重水素交換 - 質量分 成した．アルキル化 SufE は脱硫酵素 SufS と結合して， 析法を開発した．そして，大腸菌の SufS（PLP 依存型 接触面でのアミド基 D → H 交換を遅らせた．しかし， L-Cys 脱硫化酵素）と SufE（硫黄輸送タンパク質）にお 化学修飾を受けた Cys51 残基の周辺は D 保持能が低下 いて，双方の残基レベルでのタンパク質の分子間での することを示した．Singh ら 3）は，アルキル化 Cys 残 接触を解析している．この巧妙な手法は，アミド水素 基とは硫黄を受け取った状態，すなわち，過硫化 Cys （-CO-NH-）の溶媒中の水または重水の H/D との速やか 残基の類似であると考えている．そして，アルキル化 な交換現象に基づく．しかし，接触する残基の同定に Cys 残基周辺に溶媒分子が入り込む余地が生じたこと NMR を使うのではなく，短時間のペプシン消化で得 は，硫黄を受け取った Cys51 残基の周辺構造での大き られるペプチド分解物を高分解能質量分析計で同定す なコンフォメーション変化を示唆していると考察して ることで重水素を保持する領域を特定するものであ いる． る． 質量分析計を用いればタンパク質内の H/D 交換をペ タンパク質分子内のアミドプロトンの交換速度は， プチドレベルで解析できることは理屈では理解できる その場所によってかなり大きく異なる．溶媒と接する が，その実現には以下にあげるいくつかの技術的な工 タンパク質表面では H/D 交換は 15 秒以内ということ 夫を要するのである．まず，高濃度のタンパク質を用 で，いくら手際よく作業しても MS 解析に持ち込むこ いて複合体形成の有無による比較によって H/D 交換速 とは困難である．ところが，タンパク質内部やタンパ 度の差を相対的に測ることである．SufS-SufE の複合 ク質分子同士の接触面では，溶媒との接触が強く制限 体形成の解析手順は，1）D2O 中での全アミド水素の重 されるために H/D 交換に要する時間は，数分から 1 時 水素化→ 2）複合体形成→ 3）H2O を加えての D → H 間 弱 の 長 い 時 間 を 要 す る．Singh ら 3）は， 脱 硫 酵 素 置換，の三段階を経て行われる．対照実験では複合体 SufS に お い て は，PLP 結 合 Lys226 を 含 む 225-236 の 形成をさせず，SufS と SufE をそれぞれ単独のタンパ 内部ループ領域と硫黄を運ぶ Cys364 を含む 356-366 ク質として 1）と 3）の処理を行う．この対照実験との の外部ループ領域（図 2）が，アミド交換時間に 10 分 比較により，複合体内部で強く保持されたアミド重水 間から 1 時間程度の大きな差が生じることを示した． 素 D がペプチド断片の質量数増加として解析すること また，硫黄輸送体 SufE 側でも 38-56 のループ＋ヘリッ ができる．ここで用いられるタンパク質は 1.5 mM と クス領域と 66-83 のヘリックス＋ストランド領域（図 いう高濃度なので SufS（88.8 kDa）は 11 mg/mL，SufE 3）が水素交換時間にして 10 分以上の時間差が生じる （15.8 kDa）では 2 mg/mL の溶液を調製する．その 2μL ことを明らかにした．なお，SufE では前者の 38-56 領 を 23μL の D2O と混ぜて 25℃で 8 分間，重水素化を 域のループに含まれる Cys51 が過硫化体（-S-SH）を形 行 う．D → H へ の 置 換 の た め に は さ ら に 250μL の 成する役割を担う． H2O を添加して，そこから D → H への置換が進行す Singh ら 3）は，硫黄の授受に関わる Cys51 残基をヨー るタンパク質を経時的にギ酸で沈殿させることで測定 ドアセトアミドで化学修飾し，SufS には結合できるが サンプルの調製を行っている．つぎに，質量分析計で ϲϲͲϴϯ ϮϮϱͲϮϯϲ <ϮϮϲ ϱϭ ϯϴͲϱϲ ϯϱϲͲϯϲϲ W>W ⣲ 図 2 SufS におけるアミド重水素が強く保持される領域 ［225-236］と［356-366］ （文献 3 を参照して作成）． ᙉ ᣢ 図 3 SufE におけるアミド重水素が強く保持される長い 領域［38-56］と［66-83］ （文献 3 を参照して作成）． トピックス 82 〔ビタミン 89 巻 測定可能なペプチドへと調製する過程では，酸性で働 文 献 くペプシンが用いられる．その操作は，氷上にて 5 分 間のみのごく短時間のインキュベートである．この条 1）Jeffrey PD, Bewley MC, MacGillivray RT, Mason AB, Wood- 件では，基質となるタンパク質のごくわずかな割合し worth RC, Baker EN (1998) Ligand-induced conformational かペプシン消化を受けていない可能性が高いが，でき change in transferrins: crystal structure of the open form of the N- るだけ長い断片のペプチドを得ることと，質量分析計 が高感度であるため必要とされるペプチドの物質量は terminal half-molecule of human transferrin. Biochemistry 37, 13978-13986 2）Outten FW, Wood MJ, Munoz FM, Storz G (2003) The SufE pro- ごく微量でよいことであろう．これは，高度で熟練し tein and the SufBCD complex enhance SufS cysteine desulfurase た実験技術が最先端の分析器機を活用した好例といえ activity as part of a sulfur transfer pathway for Fe-S cluster as- る． sembly in Escherichia coli. J Biol Chem 278, 45713-45719 3）Singh H, Dai YY, Outten FW, Busenlehner LS (2013) Escherichia Key Words：Sulfur Transfer, H/D exchange, Iron-sulfur cluster coli SufE Sulfur Transfer Protein Modulates the SufS Cysteine Desulfurase through Allosteric Conformational Dynamics. J Biol Chem 288, 36189-36200 Department of Bioresources Chemistry, Graduate School of Environmental Life Science, Okayama University Takashi Tamura, Kaori Asano 岡山大学大学院環境生命科学研究科 田村 隆，浅野 香織
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