疎水化ポリ(-グルタミン酸) からなるユニマーナノ粒子のアジュバント機能評価大阪大学工学部応用自然科学科応用化学コース明石研究室町中翔太ワクチン治療疾病の感染免疫獲得液性免疫感染細胞性免疫ウイルス細胞障害性 T細胞体内の免疫システムが侵入したウイルスに応答ウイルス抗体感染予防感染治療 W. R. Heath et al., Nat. Rev. Immunol., 1, 126 (2001). 1 ワクチン治療ワクチン治療免疫獲得液性免疫擬似感染細胞性免疫ワクチン抗原細胞障害性 T細胞体内の免疫システムが投与されたワクチン抗原に応答ウイルス抗体感染予防感染治療 W. R. Heath et al., Nat. Rev. Immunol., 1, 126 (2001). ワクチンの種類・生ワクチン (はしか) ⇒ 効果は高いが、安全性に不安あり・不活化ワクチン (日本脳炎) ・成分ワクチン (インフルエンザ) ⇒ 安全性は高いが、生ワクチンほどの効果は見込めない高い安全性と効果を兼ね備えたワクチンが求められている 1 アジュバントとは免疫誘導メカニズム細胞活性化ワクチン抗原擬似感染抗原取り込み促進アジュバント抗原提示免疫誘導抗原提示細胞アジュバント：ワクチン抗原と共に投与して、その効果を増強する物質アジュバントの種類取り込み効率の向上抗原提示細胞の活性化・水酸化アルミニウム・毒素 (モノリン脂質) ・O/Wエマルジョン・核酸・ナノ粒子 (NPs) ・サイトカインアジュバントの問題点・効果と毒性がトレードオフの関係にある・実用化例は限定的 2 -PGA-Pheナノ粒子を用いたアジュバント開発 : poly(-glutamic acid) (-PGA) 親水性 : L-Phenylalanine (Phe) 疎水性 ethylester -PGA-graft-L-Phe (-PGA-Phe) 両親媒性生体適合性、生分解性に優れるポリマー NPs 粒径 30-200 nm -PGA-Phe 疎水性相互作用抗原 -PGA-Phe ナノ粒子 (NPs) (任意に粒径制御可能) T. Akagi et al., Biomaterials 28, 3427 (2007). 細胞活性化 Toll-like receptor 4 (TLR4) -PGA-Phe NPsの受容体と考えられている抗原内包 -PGA-Phe NPs 取り込み効率向上抗原提示細胞 T. Uto et al., Biomaterials 32, 5206 (2011). K. Takeda et al., Int. Immunol. 17, 1 (2005). 3 NPsの粒径効果とユニマーナノ粒子 NPsと抗原提示細胞との相互作用取り込み量の粒径効果取り込み量の多さ粒径小＜粒径大細胞活性化能の粒径効果細胞活性化の強さ粒径小＞粒径大 H. Kim et al., Adv. Funct. Mater. 20, 3925 (2010). 親水性部位ポリマー会合数大小疎水性部位自己会合自己会合分子間相互作用分子内相互作用 30-200 nm NPs T. Akagi et al., Langmuir 28, 5249 (2012). P. Piyapakorn et al., Macromolecules 46, 6187 (2013). -PGA-Phe 5～10 nm ユニマーNPs (uNPs) 会合数1 4 本研究の目的 ①-PGA-PheからなるuNPsの調製疎水基導入率低 uNPs 粒径：5 -10 nm 会合数1 疎水性相互作用が弱く粒子形成に至らない高 NPs (塩濃度調節で粒径制御可能) 粒径：30 -200 nm ③マウス免疫実験による免疫誘導効果評価 ②uNPsの抗原提示細胞に対するアジュバント機能評価細胞活性化？ : 抗原 : uNPs TLR4 取り込み促進？抗原提示細胞高い安全性と効果を兼ね備えたワクチンアジュバントの創製 5 本研究の目的 ①-PGA-PheからなるuNPsの調製疎水基導入率低 uNPs 粒径：5 -10 nm 会合数1 疎水性相互作用が弱く粒子形成に至らない高 NPs (塩濃度調節で粒径制御可能) 粒径：30 -200 nm ③マウス免疫実験による免疫誘導効果評価 ②uNPsの抗原提示細胞に対するアジュバント機能評価細胞活性化？ : 抗原 : uNPs TLR4 取り込み促進？抗原提示細胞 5 -PGA-Phe の合成 -PGA 親水性 pKa = 2.3 ＋ 1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl) carbodiimide (EDC) -PGA-Phe 両親媒性 50 mM NaHCO3 Phe 疎水性 T. Akagi et al., Biomaterials 28, 3427 (2007). Table 1. Synthesis of -PGA-Phe copolymers. -PGA (unit mmol) EDC (mmol) (mmol) ※-PGA-Phe-15 2.4 2.4 -PGA-Phe-30 2.4 -PGA-Phe-40 -PGA-Phe-50 Code ※ L-Phe/-PGA Yield (%) *G. D. (%) 0.6 0.25 83 15 2.4 1.2 0.50 55 30 2.4 2.4 1.8 0.75 54 40 4.7 4.7 4.7 1 56 50 -PGA-Phe-15 indicates the grafting degree of L-Phe is 15%. L-Phe G. D. : Grafting degree *Grafting degree was measured by 1H NMR. 6 -PGA-Phe uNPsの調製 -PGA-Phe uNPsの調製法粒径分布 20 15 Volume (%) -PGA-Phe (G. D. ≦40%) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に分散させuNPs形成動的光散乱法による粒径測定及び静的光散乱法による分子量測定 -PGA-Phe-40 系列3 10 -PGA-Phe-30 系列1 -PGA-Phe-15 系列2 5 0 T. Akagi et al., Langmuir 28, 5249 (2012). P. Piyapakorn et al., Macromolecules 46, 6187 (2013). 1 10 100 Diameter (nm) Table 2. Characterization of -PGA-Phe unimer NPs. ポリマー1本鎖からなる構造体を形成している Sample Calculated Mw (kDa) PDI Diameter (nm) ζ-potential (mV) Measured Mw (kDa) *Nagg -PGA — — 3±1 — 122 ― -PGA-Phe-15 147 0.47 5±1 -18±2 189 1.3 -PGA-Phe-30 178 0.60 9±1 粒子形成していない 192 0.43 13±1 -40±5 260 uNPs形成 277 1.5 -PGA-Phe-40 Nagg : Aggregation number -37±1 Measured M 疎水性ドメインの形成の確認が必要 N = *Naggの算出 1.4 w agg Calculated Mw 7 -PGA-Phe uNPsの疎水性ドメイン評価 CBB G-250 (Coomassie Brilliant Blue) 32-1000 g/mL uNPs in PBS CBB (0.1 mM) ナノ粒子の疎水性ドメイン検出吸光測定 (400-800 nm) 極性溶媒: 584 nm 非極性溶媒: 618 nm C. D. Terrië et al., Colloid Surf. A, 220, 105 (2003). -PGA-Phe uNPs T. Akagi et al., Langmuir, 26, 2406 (2010). 吸光度のピークシフト -PGA-Phe-40 1.4 1.2 1 mg/mL 30 0.5 1 0.25 0.8 0.125 0.6 0.06 (nm) Absorbance 40 shift 0-PGA 20 -PGA-Phe-15 0.25 -PGA-Phe-30 0.5 0.03 0.4 -PGA-Phe-150 →粒子形成していない 0.2 0 400 10 -PGA-Phe-30,40 →uNPsを形成 -PGA-Phe-40 0.75 -PGA Measured M -PGA-Phe-30,40はuNPsを形成することを確認した 0 250 500 750 500 600 700 800 w Wavelength (nm) 0 Concentration (g/mL) 1000 8 本研究の目的 ①-PGA-PheからなるuNPsの調製疎水基導入率低 uNPs 粒径：5 -10 nm 会合数1 疎水性相互作用が弱く粒子形成に至らない細胞活性化？ : uNPs NPs (塩濃度調節で粒径制御可能) 粒径：30 -200 nm ③マウス免疫実験による免疫誘導効果評価 ②uNPsの抗原提示細胞に対するアジュバント機能評価 : 抗原高 TLR4 取り込み促進？抗原提示細胞 -PGA-Phe uNPsの取り込み評価 -PGA、-PGA-Phe-15、uNPs30 uNPs40、NPs (200 nm) in PBS 培養 24h 濃度 : 125、250、500 g/mL (37 oC, 5% CO2) 0.5% Triton X-100 in 0.2 M NaOH aq 取り込み 0.5, 1, 2, 3h 30 min 蛍光測定 RAW264 マウスマクロファージ様細胞株 (抗原提示細胞の一種) T. Akagi. et al., Biomaterials, 32, 4959, (2011). 2×105 cells 取り込み時間統一 (取り込み1h) 5000 4000 3000 -PGA-Phe NPs (200 nm) 2000 1000 0 0 100 (濃度500 g/mL) 6000 200 300 400 Concentration (g/mL) 500 Uptake amount (ng/2×105 cell) 6000 Uptake amount (ng/2×105 cell) 粒子濃度統一 5000 4000 3000 -PGA-Phe NPs (200 nm) 2000 1000 0 0 60 120 Incubation time (min) 180 9 -PGA-Phe uNPsの取り込み評価 -PGA、-PGA-Phe-15、uNPs30 uNPs40、NPs (200 nm) in PBS 培養 24h 濃度 : 125、250、500 g/mL (37 oC, 5% CO2) 0.5% Triton X-100 in 0.2 M NaOH aq 取り込み 0.5, 1, 2, 3h 30 min 蛍光測定 RAW264 マウスマクロファージ様細胞株 (抗原提示細胞の一種) T. Akagi. et al., Biomaterials, 32, 4959, (2011). 2×105 cells 粒子濃度統一 (取り込み1h) 6000 120 Uptake amount (ng/2×105 cell) Uptake Uptakeamount cell) amount(ng/2×10 (ng/2×1055cell) 取り込み時間統一 5000 100 4000 80 3000 60 2000 40 1000 20 00 00 100100 200 200 300 300400 400 500 Concentration (g/mL) Concentration (g/mL) (濃度500 g/mL) 140 120 100 80 60 H. Kim et al., Adv. Funct. Mater. 20, 3925 (2010). 40 20取り込み量の多さ 500 粒径小＜粒径大 0 uNPsでも粒径の小さな 60 120 180 Incubation time (min) NPｓと同様の傾向 uNPsの濃度、取り込み時間に依存した細胞への取り込みが明らかとなった -PGA-Phe NPs (14 nm) uNPs40 -PGA-Phe uNPs30 uNPs 0 -PGA-Phe-15 sol -PGA g-PGA 9 -PGA-Phe uNPsの細胞活性化能評価培養 24h (37 C、5% CO2) -PGA、 -PGA -phe-15、 uNPs、NPs (200 nm) in PBS 濃度 : 500 g/mL o RAW264 (マウスマクロファージ様細胞株) TLR4 抗原提示細胞 ** ** 3000 ** (n = 3) TNF-a (pg/mL) 炎症性サイトカイン産生細胞活性化 ELISAにより炎症性サイトカイン TNF-産生量評価 TNF-: Tumor necrosis factor ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay 細胞活性化によるサイトカインの産生 uNPs 培養 24h (37 C、5% CO2) 上清回収 o 2000 1000 0 uNPs40は高い細胞活性化能を持つことが明らかとなった PBS -PGA -PGA uNPs30 uNPs40 NPs ** p < 0.01 -Phe-15 (200 nm) 10 本研究の目的 ①-PGA-PheからなるuNPsの調製疎水基導入率低 uNPs 粒径：5 -10 nm 会合数1 疎水性相互作用が弱く粒子形成に至らない細胞活性化？ : uNPs NPs (塩濃度調節で粒径制御可能) 粒径：30 -200 nm ③マウス免疫実験による免疫誘導効果評価 ②uNPsの抗原提示細胞に対するアジュバント機能評価 : 抗原高 TLR4 取り込み促進？抗原提示細胞 -PGA-Phe uNPsによる免疫誘導皮下投与 + C57BL/6 0 or -PGA-Phe uNPs及び OVA内包NPs 卵白アルブミン (OVA) OVA 10 g/shot NPs, uNPs 200 g/shot Spot forming (unit/well) 200 400 14日目 2回免疫脾臓回収 (0、7日目) (n = 3) OVA特異的な細胞性免疫の誘導評価 (IFN- ELISPOT) IFN-: Interferon- ELISPOT: Enzyme-linked immunospot 600 PBS 単位重量当たりの比表面積 uNPs > NPs (200 nm) (約5.3倍) (n = 3) OVA -PGA + OVA OVA-NPs (200 nm) Alum + OVA NPs (200 nm) + + + ** ** ** ** uNPs40 + OVA uNPs + -PGA -Phe-15 + OVA uNPs30 + OVA 細胞活性化 uNPs > NPs (200 nm) TLR4 抗原提示細胞 uNPs40は高い免疫誘導効果を有することが解明された (Alum: 水酸化アルミニウムゲルアジュバント) ** p < 0.01 11 考察: TLR4による認識と疎水化度の関係同じuNPsでも、疎水基導入率の違い (30%と40%) で免疫誘導効果が大きく異なった TLR4によるリガンド認識キャリアの疎水化度と免疫応答の関係疎水性部位 S. Y. Seong et al., Nat. Rev. Immunol., 4, 469 (2004). 疎水性相互作用によりTLR4はリガンド認識を行い、免疫応答を示す免疫応答疎水化度が高いほど免疫誘導効果が高い uNPsによる免疫誘導効果は一定以上の D. F. Moyano et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 3965 (2012). 疎水基導入率が必要な可能性が示唆された 12 総括疎水基導入率15%の-PGA-Pheでは-PGA-Phe uNPsは形成されなかったが、導入率30%、40%の場合ではuNPsの形成が確認された -PGA-Phe uNPs40は従来用いられてきた粒径200 nmの-PGA-Phe NPsよりも高い細胞活性化能を有することを見出した -PGA-Phe uNPs40は既存のアジュバントや、粒径200 nmの-PGA-Phe NPs と比較して、高い免疫誘導効果が得られることが明らかとなった -PGA-Phe uNPsは、ある一定以上の疎水基導入率を持つときのみ、高い免疫誘導効果が得られることが示唆された -PGA-Phe uNPsを用いた高い安全性と効果を兼ね備えたワクチンアジュバントの開発が期待される 13