匂恩義思恩阻成事業 2001年度日中医学協会共同研究等助成事業報告書一在留中国人研究者研究助成一 2002年 3 月 6 日財団法人日中医学協会理事長殿所属機関名匂呉超然研究者氏名新潟大学医学部麻酔学講座馬場洋指導責任者氏名教授臓名所在地〒 9 51・ 8510新潟市旭町通 1 ・ 757 電話 ( 0 2 5 ) 2 2 7，' 2 3 2 8 内線 1.研究テーマ軽度前脳虚血による C57BU6マウスの虚血耐性発現に関する研究 2 .，本年度の研究業績 (l)学会・研究会等における発表 ③ ・無 (学会名・演題} 第・5 ' 4回新潟麻酔懇話会程度前脳虚血による C57BU6マウスの虚血耐性発現に関する研究新潟大学麻酔科学教室 ( 2 ) 学会誌等に発表した論文，呉超然、富士原秀善、戚思華、多賀紀一郎、馬場洋 ⑧・無 (雑誌名・論文名) 1 . ChaQ l ' a n _ W . ! ，R e n z h iZh 叩，S i h u aQi，H i d e y o s h iF u j i h a r a，K ii c h i r oTaga，KokiS h i m o j i .A f o r e b r a i ni 5 c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n gmodel e s t a b l i s h e di nC 5 7 B l a c k l C r j 6s t r a i nm i c e .J N e u r o s c i e n c eMethods1 0 7( 2 0 0 1 )1 0 1・1 0 6 . ，H i d e y o s h iF u j i h a r a，K ii c h i r oTaga，S i h u aQi，MakotoN a i t o， 2 . R e n z h iZhan，ChaoranWIy K o k iS h i m o j. i Both c a s p a s e d e p e n d e n t and i n d e p e n d e n tp a t h w a y sa r ei n v o l v e di n ' h i p p o c a m p a lCAln e u r o n a ld e a t hduet oI O S 5o fc y t o c h r o m ecf r o mm i t o c h o n d r i ai nar a t ， f o r e b r a i ni s c h e m i amode. lJC e r e bB l o o dAowMetab2 1: 5 2 9 ・ 5 4 0 . 3 .R e n z h iZh 佃， S i h u aQi，Chaoranwiy ，H i d e y o s h iF u j i h a r a，K ii c h i r o1 1 唱a ，K o k iS h i m o j i . e r e n t i a l l yr e d u c e n e u r o t r a n s m i s s i o n damage c a u s e d by I n t r a v e n o u sa n e s t h e t i c sd i百' o x y g e n g l u c o s ed e p r i v a t i o ni nr a th i p p o c a m p a ls l i c e si nc o r r e l a t i o nw i t hNMDAr e c e p t o r .Vo . I2 9 . N o . 4 ( 8 0 8 8 1 3 ) . i n h i b i t i o n .C r i tCareMed.2001 - 1 8 5 _ 2328 3 . 今後の研究計画脳虚血により起きる神経細胞死に対し、 BDNF ， FGF ， EGFに代表される神経栄養因子がどのような細胞保護効果をもたらすか、そして、その効果が c ytochrome cの放出と B c l 2とどのように関連しているかを探求する計画である。免疫組織化学や生化学的手法を駆使して、ミトコンドリアを介したアポトーシスを中心に評価する。加えて、 BDNF遺伝子、 EGF受容体遺伝子のノックアウトマウスを利用して、内在性のこれら神経栄養因子の役割についても考察したい。 4. 研究指導者の意見呉超然氏は 1999年に来日し、本学医学部麻酔学教室に客員研究員として入局しました。翌年 4月には本学医学研究科博士課程(外科系・麻酔学専攻) に入学し、麻酔学教室に大学院生として在籍しています。現在、脳虚血に関する病態生理及びその蘇生について昼夜も問わず、研究に取り組んでおります。 2年生として、すでに論文も英文誌に採用され、学会口演の経験もあります。本学に入学後の学習態度は真剣であり、強い向学心を有していることが窺えます。呉超然氏は大学院生としてのふさわしい学力に加えて、日本語に関しても、日常生活はもとより研究を行う上でも十分に高い語学力を有していると判断されます。以上のように呉超然氏は今後優れた研究を行うことが期待される人物であります。研究指導者氏名馬場洋金 5 . 研究報告別紙形式により、報告本文4 0 0 0字以上(英文は 2 6 0 0 語以上)で報告して下さい(枚数自由・ワープロ使用) タイトノレ・要旨等は日本語で、 KEYWORDS以下は日本語或いは英語で記入、使用文字はタイトル 13ポイント、その他は 10ポイント、日本語は明朝体を使用して下さい。研究成果の発表予定がある場合は発表原稿・抄録集等を添付して下さい。議ìJt~警も幸弘こ当つては、日中医学協会助成事業一日本財団助成金による壱を明記してーでさい。 - 1 8 6 - 軽度前脳虚血による C57BIJ6マウスの虚血耐性発現に関する研究呉超然中国大連医科大学附属第四病院麻酔科医師日本新潟大学医学部麻酔学講座大学院生要旨脳虚血前処置分子機序の研究は、虚血性脳損傷のメカニズムの解明だけではなくて脳虚血治療法の開発にも役立つと思われる。今回、我々はまず遺伝子操作の分野でよく使われる C57BU6 マウスを用いて、マウス脳虚血前処置モデルを作成し、そして神経細胞の生と死と関連する B c l 2fan 語I yタンパクの発見について経時・定量的に検索する。雄性 C57BU6マウスを用いた。前脳虚血は、両側の総頚動脈を閉塞することによって行った。 s h a m コントロール)、虚血群 ( 18分間虚血)と前処置群 (6分間虚血後 48時間後対照群 ( 18分間虚血)に分けた。線条体損傷は凍結切片に行われる MAP-2染色によって評価した。 Bc I 2タンパクを定量的に測定するために、 6分間虚血後再潅流 4時間、 24時間、 4 8時間、 72 時間、 1週間ごとに脳を取り出して、皮質、海馬、線条体をそれぞれ剥離し、 W白飽m b l o t の方 I -2タンパクを定量的に測定し、バンドの光学密度を評価する。法を用いて、 Bc 虚血後の残存神経細胞数は虚血群に比較して前処置群で有意に多かった。虚血群においては、 MAP-2免疫染色はほぼ完全に脱落した。前処置群では対照群に比べて MAP-2免疫染色は若干減弱したがずかなり正常に近い状態で染色された。 6分間虚血後、線状体において Bcl-2タンパクの量が増える一方で 48時間の時点でピークに達した。 C57BU6マウスにおいて、軽度前脳虚血はその後の致死性脳虚血に対して保護作用があること c l -2タンパクの増加と関連があると示唆する。が示唆された。この保護作用は短期間虚血による B Keyword:C57BU6m i c e ;B c l 2 ;I s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n g ;S凶 a t u m ;S u b l e t h a li s c h e m i a 叫u c 舗00 I o t r l 百l eb c l 2p r o t か叩c o g e 関 i sf i r s td i田 o v e r e di nb c e l lIymphoma創叫 av a r i e t yofo t h e rc a n 回目 σs 吋i m o t oe ta I . ， 1 9 8 5 ) . I ti sa l s oob 田r v e di n由e田 o t r a ln e r v o u ss y s t e m(CNS)d町 i n gem 耐y 佃 i c 也: v e l 叩皿e n t( L e Brune ta I . ，1 9 9 3 ;NovackandKorsmeyer ，1994)， b u tl e v e l sa r eg r e a t l yd o w n r e g u l a t e di n t h em母o r i t yo fpo 羽m i t o t i cCNS即日r o n so fa d u l tb r a i n(M釘I Ye ta I . ， 1 9 9 4 ) . 百l eb c J 2f a n u l yof oncogen 回開c o d e ss p e c i f i cp r o t e i n st h a tr e 伊l a t e叩 o p t o s i si n d u c e dbyav a r i e t yo fs t i m u 1 i(Vauxe ta I . ， 1 9 8 8 ;Da v i e s1 9 9 のAm ong出e s er e l a t e dp r o 包i n s，B c l 2andBc J x ls u p p r e s sa p o p t o t i cc e l ld 朗自， w h e r e a sBaxpromotei t( O l t v a ie ta I . ， 1 9 9 3 ) . Changesi n白eb c l ・2f a r 凶l yg e n e sl e v e l sh a v eb 田n l ya s6t o8h o u r sa f t e ri s c h e m i a( K r 亀j e w s k . ie ta l .，1 9 9 5 ;Chene ta l .，1 9 9 6 ;Antonawiche t o b s e r v e d部回r a I . ， 1 9 9 6 ) . Ther e f l 自己，i th部 a t t r a c t e d出emosta t t e n t i o nt h a t出ec o u n t e r r e 伊 l a 旬de x p r e s s i o no fB c l 2 oemer f a n u l yp r o t e i n sd e t e r m i n e sw b e t h e rn e u r o n st o w a r ds u r v i v a lo ra p o p t o s i s( Y a n gEe ta l .，1996，Kr 9 9 7 ) . G .，1 - 1 8 7 - Moste v i d e n c ei n d i c a t e dt h a ta 抑p t o t i c田 Id e a t hmayocc町 a f t e rt r a n s i e n t国間b r a li s c b e m i aa n d白紙 d y s r e g u l a t i o n ofB c l ・2a nd r e l a 凶 p r o t e i n sa c 白 l e r a t e si s c h e m i cn e u r o n a li 吋u r y . F u r t h e n n o r e ，a 凶 cp r e c o n d i t i o n i n gm峨 1i nC57Blac k / C r j 6(C57BU6)sU∞ d e v e l 叩edr e c e n t l yi no u r f o r e b r a i ni s c h e l a b o r a t o r yh a sshownt h a ts 凶 t a ln e u r o n a li 吋urya 伽回l s i e n tb i l a t e r a lcomm 叩 c a r o t i d制 : e r yo c c l u s i o n ，叩g l yr ，吋u c e dbyas u b l e t h a li s c h e m i ce p i s o d e(W U CRe ta l . '2 0 0 1 ) . Toa d d r e s st h e (BCCAO)c a nbes t r q u e s t i o oo fw h e t h e rt h e 田 Bc I2f r u : 凶I yp r o t e i n sp a r t i c i p a t ei n出eωcurren 回 o fi s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n g p r o t e c t i o ni n d u c e dbys u b l e t h a lf o r e b r a i ni s c h e m i ， a weexaminedBcl-2，Bc I x J ， andBaxe x p r e s s i o nby 位i a t u mandf o l l o w i n g6DUno fs u b l e t h a l i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yandi m m u n o b l o ta s s a y si nt h enonnals 田. f o r e b r a i ni s c h e D U ai nC57BU6mi O b j e c t i v e s c b e m i cp r 配 o n d i t i o n i n gm似たIi nC57BU6mi田 . And白enaimedt oa d d r e s st h e Wed e v e l o p e d叩 i q u e s t i o no fw h e t h e rBc I 2f a m i l yp r o 飽i n sp a r t i c i p a t ei nt h ei n d u c t i o no fi s c h e m i ct o l e r a n c e . Asa p r e l i m i n a r ye x p e r i m 佃 t ， wee x r u : n i n e di fi s c h e m i cp r ，配o n d i t i o n i n ga l t e r se x p r e s s i o no f叩 o p t o s i si n h i b i t o r Bc I2 ，B c l x l， anda p o p t o s i sp r o m o t e rBaxbyu s i n gwestemb l ot . M a t e r i a l sandMethods I n d u c t i o no ff o r e b r a i ni s c h e m i a na d u l tmaleC57BU6mi 田 w e i g h i n g1 9t o2 3g( 8 ・1 0weekso l d ) . E x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e d叩 ti ∞ Ani m a l swe 陪a1 lowedf r e ea ∞ 回st oi t dandw a t e randh o u s e di nac 1i m a t e c o n t r o l l e de n v i r o n m e n t C ) . F o r e b r a i ni s c h e m i awωinducedbyb i l a t e r a lcommonc a r o t i da r t e r yo c c l u s i o n(BCCAO)f o r1 8 ( 2 5' min u n d e r 1.0% b a l o t haneJ o x y g e na n e s t h e s i av i aa f a c em a s k . D u r i n gt h ep r ' ω e d u r e ，t h er e c t a l t e m p e r a t u r ewasm a i n t a i n e db e t w e c 沼 3 6 . 7and3 7 . 5' C . A f t e rr e p e 巾 s i o n，t h ea n i m a l swerec a r e di na W釘 m，h u m i d i f i e dchamber( 3 2 ・3 3' C )f o ra n o t h e r3h o u r sb e f o r eb e i n gr e t u r n e dt ot h e i rc a g e s . F o r p r e c o n d i t i o n i n g ，r u : 岨malsw 釘' es u b 長c t e dt oaふminBCCAO48hb e t i ぽ e出 e1 8 m i ni s c b e m i a . 百le a n i m a l su n d e r w e n te x p o s町 e o fb i l a t e r a l common c a r o t i da r t e r i e sw i t h o u t BCCAO were used 箇 s h a m c o n t r o l s . Tr 佃 s c a r d i a cpe 巾 s i o na n db r a i nt i s s u ep r e p a r a 低価 On出e7 由 d aya f t e rr e p e r f u s i o n ， a n i m a l swerer e a n e s t h e t i z e dby叩 i n t r a p e r i t o n e a li n j 配 t i o no fsodium p e n t o b a r b i t a l( 150m glkg)andt r a n s c a r d i a c a l l yp e r f u 碍 dwi 白 0 . 1M PBSc o n t a i n i n gh e p a r i n( 4u n i ω ' m l ) ， f o l l o w e d by 0 . 0 1 M p e r i 叫a 島 E・0 . 0 7 5 M l y s i n e -2% parafonnaldehyde (PLP) i n 0 . 0 3 7 5 M 吋 s o l u t i o n(pH6.3).百lewholeb r a i nwasremovedfromt h es k u l landp o s t f i x e di nt b e p h o s p h a t e b u偽 r samef i x a t i v ef o r4h . T h e r e a f t e r ，t h eb r a i n swerewashedi ng r a d u a l l yi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n sof n0 . 1 M PBS (10% f o r4 h，15% and20% f o r1 2he a c h )甜 dt h e nr a p i d l y 合o z e ni n s u c r o田 i 2 m e t h y l b u t a n ec h i l l e da t・80' C . C o n s e c u t i v ec o r o n a ls e c t i o n s( 16阿n )werep r e p a r e donaDUcrotome andu s e df o rm i c r o t u b u l e a s s o c i a t e dp r o t e i n 2(MAP-2) i m m u n o h i s t o c h e sUs t r ys t a i n i n g . Fori ns i t u - 1 8 8 - d e t 自由no fDNAf r a g m e n t a t i o n，a n o t h e r田 tofa n i m a l s werepe 巾s e dw i t h0 . 1 M PBS c o n t a i n i n g h e p a r i n( 4u n i t s / m J )f o l l o w e dby20%s u c r o 担 i n0 . 1M PBSa t72ha f t e rr e 戸巾s i o n . 百 eb r a i n swere t h e nremoved合omt h es k u l l， andr a p i d l y合ozeni n2 ・m e t h y l b u t a n ec h i l l e da t・80' C . Assessmento fn e u r o n a ldamage I s c h e m i cn e u r o n a ldamagew槌 v i s u a l i z e dbyMAP-2immunohistochemi 紺y . B r i e f l y ，田c t i o n swere p o s t f i x e dw i t h4%p a r a f ，叩n a l 制 l y d ei nO. lM PBSf o r1 0minandwa 由e d t h r 館山leSw i t h0. 1M PBS. Endogenous戸:ro x i也 s ewasi n a c t i v a t e dbyi n c u b a t i n gt h e蹴 t i o n sw i t h却 %m e t h a n o lc o n t a i n i n g0 . 1% ~02 ( v / v )f o r45m i n .S e c t i o n swere出伺 f o l l o w e dbys e q u e 凶 a li n c u b a t i o n si n1 )2.5%h o r s eserumi n 0. 1M PBScontaining0.2%Tw田 n・20and1 .5%BSAf o r60min， 2 )a n t i ・MAP-2m onoclonala n t i b o d y ( B o e h r i n g e rMaMhei m ， Mannheim ， Genn a n y )d i l u t e di n0 . 1M PBSa t4' C overnight，3 )b i o t i n y l a t e d b o r s e釦 6・m側回 I gGf o r60min， and4 )a v i d i n b i o t i n 戸r o x i 由民 c omplexi n0 . 1M PBSf o rωmin. 百le b i o t i n y l a t e ds 配 o n d a r yan 曲叫y 卸 d 曲e a ' 叫d i n b i o t i n p e r o x i 也記 W釘 ep u r c h a s e d from V e c t o r La b o r a t o r i e s( B u r l i n g a m e ， CA). 百 leMAP-2i m m u n o r e a c t i o nw部 v i s u a l i z e dbyi n c u b a t i n gt h e田 c t i o n s w i t h0.05%3， 3 ' d i a m i n o b e n z i d i n eand0.002%HP2 ・ I ns i ω l a b e l i n gofDNA食a g m e n t a t i o n Byu s i n gana p o p t o s i si ns i回 d e t e c t i o nk i t(W akoPureChemicalI n d u s t r i e s ，Os紘 a，J a p a n )，t e r r 叫n a l dωxytr 叩 s f e r a s e m e d i a t e ddUTP-nickendl a b e l i n g(TUNEL)wasc a r r i e do u tonn o n f i x e ds 配 t i o n s( 1 6 μ m ) . S e c t i o n swerep侶 t ・f i x e dwi 白 4%p a r a f o r m a l d e h y d ei n0 . 1M PBSf o r1 5mina troomt e m p e r a t u r e， f o l l o w e dbye t h a n o V a c e t i ca c i d( 2 : 1 )f o r5mina t・20' C ，加dt h e np e n e t r a t e dwi血 3 l J もT r i t o nX・looinO.l M PBSf o r60mina 1r ∞m temperature. 百l e田 c t i o n sweret h e ni n c u b a t e di nTUNELr e a c t i o ns o l u t i o n f o r60mina t37' C . A f t e rw踊 h i n g，s e c t i o n swerei n c u b a t e di n30%~02 i n0 . 1M PBSf o r1 0mint o quenchendogenousp e r o x i d a 路 a ndi n c u b a t e dwi出制t iF l TC ・c o n j u g a t e dp e r o x i d a s ef o r60mina t37' C . TUNEL-positive回 I I swerev i s u a l i z e dw i t hd i創凶 n o b e n z i d i n e . I d e n t i c a lt ot O Oa s s e s s m e n to fi n t a c t n e u r o n s ， TUNEL-positivec e l l swerec o u n t e di nf i v e部 s i g n e ds u b r e g i o n s . Westemb l o ta n a l y s i s I m m e d i a t e l ya f t e rd邸 a p i t a t i o na t4，24 ，48，72h，組d7dayf o l l o w i o g6mioi s c h e m i a( 0=1 2per g r o u p )， mou田 S凶 aωmw ，踊 d i s 田 c t e d ， andhomogenizedi nRIPA以l f f e rc o n t a i n i n gp r o t e a 民 i n h i b i t o r son ∞ i c e . A f t e rc 叩，t r i f u g a t i o na t1 4 ， 0 gf o r30m i n u t e s， t h e鎚 :rumw 笛 c o l l e c 俗d .Thep r o t e i nl e v e l swere qu 組 t i f i e dbys p e c t r o p h ω o m e t r y ，and曲el y 回t ewasb o i l e da t95i nsodiumd o d e c y ls u l f a t el o a d i n g加 f f e r ∞ ( loommol / lT r i s HCl，2 mmo V ld i t h i o u r e a ， 4%sodium由必c y ls u l f a t e，0.2%bromophenolb l u e ，and 20% g l y c e r o l ) f o r5 m i n u t e s . Then， 40μg p r o t e i ns a m p l e sw e r e .l o a 也d o n t o a 12% S D S p o l y a c r y l a m i d ege l . 百l et r 却 s f e r r e dp o l y v i n y l i d e n ed i f l u r i d e(PVD 町 membranew踊 incubatedi n e i白釘 mou田 a n t iBcI 2( 1 : 1倒 ) ( ) ，T r a n s d u c t i o nLa b o r a t o r i e s . )o rr a b b i ta n t iBc I-XL，Baxantibody(1:500， S a n t aCruzB i o t e c h n o l o g yI n c . )f o r2h o u r sa tr ∞m 飽 mperature.A負erwashingthreetimesinPBS c o n t a i n i n g0. 1% TWI 田n ・2 0 ，t h ea p p r o p r i a t es e c o n d a r ya n t i b o d yw槌 a p p l i e da ta1 : 3 0 0 0d i l u t i o nf o r1h . Th emembranew出 washedi nPBSc o n t a i n i n g0 . 1% Tween-20t h r 白血n e so v e r30sUn，泊施ni n c u b a 低di n - 189 - ECLP l u sw<白temb l o t 出. gd e t e c t i o nr e a g e n t s(Am ershamPhannaciaB i o t e c h )血 d既伊s e dt oF u j iRX f i l m( F u j i ，Tokyo，J a p a n ) .A u t o r 叫i ograms i g n a l s were q u a n t i f i e dby a g e l也 n s i t o r 即位i cs c a n n i n g p r o g r ; 創D . The r e l a t i v ep r o t e i nl e v e l s were d e t e fsUn ed from 出e r e l a t i v eo p t i c a ld e n s i t i e s of t h e c o r r 田p 叩 d i n gp r o t e i nban 也a ndweren o r m a l i z e dt obackgroundv a l u e so b t a i n e dont h e姐 melane. S t a t i s t i c a la n a l y s i s Q u 血t i t a ' 凶v e也 . t aa r ee x p r l 回鈴d錨 U抱組 : t s t a n d a r dd e v i a t i o n(SD)and組 a l y z e dbyooe-wayANOVA 叙 1 i ANOVA w a f t e rn o r m a l i t yo fd i s 回加t i o nw踊 p r o v 部 f o l l o w e dby Du n n e t t ' sp o s th 民協t~町 m u l t i p l ec o m p a r i s o n s . Ap v a l u el e s s由an0 . 0 5i sc o n s i d e r e ds t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n t . R e s u l t o nthe田崎nthdayafter18・rnini町民師i ， an e u r o n a ll o s sc o u l dbef o u n di nt h eS t r i 8 ω m ， h i p p 配細抑1 CAl，CA2 andCA3 r e g i o n s，包1<1血ec o r t e xa sw e l l回 o t l 即時，g i o n s，田 v i s 回Iiz edby MAP-2 i m m u n o s t a i n i n g . I nt h eh i p 伊伺m pus ，neuronallossalwaysoccu 町' e di nt h ed o r s a lCAlr e g i o n ，CA2錨 w e l lCA3r e g i o n . I n3o u to f6a n i m a l s， CAln e u r o n a ld a r n a g ew踊 a s y m m e t r i ca f t e r1 8 ・r n i ni s c h e r n i a . I nc o n t r a s t ，S 釘i a t a ln e u r o n a ldamagei n曲eb i l a 飽r a ls t r i a t u mw国 synune 住i candmorec o n s i s t e n t . S i n 田 n e u r o n a ldamagei n由es 回 atumw，回 morec o n s i s t e n ta f t e r血e1 8 ・r n i ni s c h e r n i a ，出ee x t e n tof p r OlJ目白nb yi s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n gwase x a r n i n e di n也es 住iaωmb yMAP2immunohistochemis 町 s t a i n i n g . I nt h e記 c t i o n so b t a i n e d企omsham c on 佐0 1a n i m a l s ， bωhsomaa r 叫d e n d r i 飽 sw erei n 加 l s i v e l y s t a i n e d . I 詑 h 佃血 f 町 6m inl r 国 u lt E 対 i nnod e t e c t a b l el o s so fMAP-2i m m u n o r e a c t i v i t yi nt h eb i l a t e r a l s 凶a t u m . An1 8 ・m ini s c h e r n i ac a u s e dn回 rc o m p l e t el o s sofMAP-2i m m u n o r l 回 c t i v i t yi n4o u to f6 創岨m a l s . A6 mini s c h e m i ce p i 回 d ep e r f l 町med48hb e f o r et h e1 8・mini s c h e m i as t r o n g l yr e d u c e dt h e l o s sofMAP-2immun 町 e a c t i v i t yduet ot h e18 ・r n i oi s c h e r n i a . Th e r e were00TUNEL-positive c e l l st oocc 町 i ns e c t i o n s ob 凶nc:姐 f roms h a m c o n t r o la n i m a l s . TUNEL-positivec e l l si n t e n s e l ye x i s t e da t72ha f t e rr e 戸巾s i o ni na n i m a l ss u b j e c 凶 t o1 8 ・r n i ni s c h e r n i a b u tn o t6・r n i ni s c h e r n i a . Again ，白. e6 min i 配 h emiap e r f o n 磁調d4 8h b e f o r et h e1 8 mini s c h e m i a s i g n i f i c 叩 t l yr e d u c e dt h eDumberofTUNE Lp o s i t i v ec e l l sc a u s e dbyt h e1 8 ・m ini s c h e m i a . Thel e v e l so fB c l 2andBc l x lp r o 也i 邸 e x p r e 凶 i o nwerei n ぽ伺s e d位om4ht o7d a y sa f t e r6mino f BCCAOwi 白 amaximumi n t e n s i t yo c c u r r e di n出e48ht i m ep o i n t . Baximmunore 配 t i v i t yw ; 出 v e r y f a i n ti ot h ea b o v ementionedt i m ep o i n t s . Di提出 s i o n Themajorf i n d i n goft h e戸田e n ts t u d yi s白紙 t r a n s i e n tb i l a t e r a lcommonc a r o t i da r t e r yo c c l u s i o n p r o d u c e sac o n s i s t e n ts 凶a t a li n j u r yt h a tc 叩 b es t r o n g l ya t t e n u a t e dbyas u b l e t h a li s c h e m i ce p i s o d e .And a l s owed e m o n s t r a t e白a tt h eB c l 2f a r n i l yp r o t e i n sp a r t i c i p a t ei nt h eprωessof白i si s c h e m i cp r o t e c t i v e e f f e c t . C u r r e n t l y ， a l r n o s ta l la v a i l a b l ei s c h e m i cp r l 目 o n d i t i o n i n gmodelsh a v eb 舘 nd e v e l o p e di nr a t so rg e r b i l s， - 1 9 0 - b u tt h i si sn o tc o r r e s p o n d i n gt ot h a tmostg e n e t i ca l t e r a t i o n sh a v e版記np e r f o r m e di nm i c e . Among d i自己r e n ts t r a i n s，白eC57BU6s t r a i nh a sb e e nshownt obemosts u s c e p t i b l et o釘a n s i e n ti s c h e m i ai n d u c e d ta l .，1 9 9 4 ;F u j i ie ta ， . 11 9 9 7 ;Yange ta l .，1 9 9 7 ) . A d d i t i 叩 a l l y ， s t u d i e sh a v eshown byBCCAO( B a r o n ee n C57BU6 凶 c ei s more c o n s i s t e n ti ncom 戸 d回目 w i t hi n j u r y 師自e t h a ti n j u r yt o恥制御 m i f e r a s h i m ae ta l .，1 9 9 8 ) . h i p p o c a m p a lCAIr e g i o n( a de x a m i r 凶 n e u r o n a ldamagei n d u c e dbyBCCAOf o r3， 4，6and8 I np r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t s，weh m i n . Al t h o u g ht h e r ewasnos 釘i a t a landh i p p o c a m p a ln e u r o n a ldamageωbef o u n da f t e r3o r4min ， t h e i rp r o t e c t i o n sa g a i n s tt h es u b s e q u e n t1 8 mini s c h e m i aw e r ew e a k e r . I nc o n t r a s t， i s c h e m i a i s c h e m i a e r i o u ss 出a t a landh i p p o c a m p a ln e u r o n a l damage. Wet h u s ch 回 ea f o r8mins o m e t i m e sc a uぉd s d u r a t i o no f6 mina s 由ec o n d i t i o n i n gi s c h e m i ci n s u lt . Whilet h eふmini s c h e m i ad i dn o t回 u s e n o t i 田 a b l es 凶a t a ln e u r o n a ldamage回 d e m o o s t r a t e dbyb o t hMAP-2immunohistωher 凶s 町民祖国n g，i t ，叩a ldamagei n d u c e dbyt h es u b s 叫u e n t1 8 mini s c h e m i a . r e n d e r e ds t r o n gp r o t e c t i o na g a i n s ti s c h e m i cn e u r Thee x t e n t so fpl'O飽c t i o na r ec o m p a r a b l ew i t h白紙 r e p o r 白 di nh i p p o c a m p a lCAln e u r o o si nag e r b i l i 記 h e r 凶 cp r e c o n d i t i o 凶n gmodel( K ir i n oe ta l .，1 9 9 1 ;K i takawae ta l .，1 9 9 0 ) . 1 0叫 d i t i o n ，wea l s of o u n d 曲a ti s c h e m i a i n d u c e dDNAf r a g m e n t a t i o nw回 a t t e n u a t e dbyt h ec o n d i t i o n c 姐 i s c h e m i a ，i n d i c a t i n gt h a t a n t i a p o p t o t i ca c t i o n smaybei n d u c e dbyt h ec o n d i t i o n i n gi s c h e m i ce p i s o d e . 恥 I Y b も施 e 主んふ山 m 目a ybes 閃 e 1m 即 t 隠 e 帥 a 削 ni s m s句 byw 州叫 h i c 川h 凶B c l ト'何ld 制 Bc l x 阻 ur o n s .B c l 2p l a y sak e yr o l ei nr e g u l a t i n gi n i t i甜 ono fprogramn 也 d回 Ud 伺出 byp r e v e n t i n ge g r e s so f 問町叩 c y t o c h r o m eC i n t oc y t o p l a s m .CytochromeC，i ntum ，complexesw i t ha p a f la c t i v a t i n gc 部 p 出 e9 ，a n i m p o r t a n tt r i g g e r i n ge v e n ti na p o p t o s i s .B c l 2maya l s op l a yar o l ei ns t a b i l i z i n gt h em i t o c h o n d r i aand m a i n t a i n i n gi t sm e r n b r a n ep o t e n t i a l，t h u sp r e v e n t i n gt h eg e n e r a t i o n of念館 r a d i c a l s . So t h a t ，t h e e x p r e s s i o no fBc I2i nn e u r o n s白紙 a r es t r e s s e dmaybeani m p o r t 叩 t e v e n tt h a te n s u r e sn e u r o n a ls u r v i v a l . Rere 間町田 An t o n a w i c hFJ， Fe<加o f fHJ， Kr a j e w s k iS， R，儀対 JC ， Da v i sJN( 1 9 9 6 )I s c h e m i cCAIh i p p o c a m p a ln e u r o n s 陪 exp 5Sb a xandc四 bere民 uedbyb c l2i n d u c t i o nw i t hah e r p e ss i m p l e xv i r u s(HSV)組 l p l i c o n( A b s t r a c t ) . ・ SocN e u r o s c iA b s t r2 2 :1 1 7 9 u d s e nDJ，N e l s o nAH ，F e u e r s飽i nGZ ，Wil l e t 飽 NR( 19 9 3 )Mou 田紺a i nd i f f e r e n c e si n BaroneFC，Kn e b r a li s c h e m i aandr e l a t e dt oc e r e b r a lv 部 c u l a ra n a t o m y .JC e r e bB l 00dF lowMetab s u s c e p t i b i l i t yt o回 r 1 3 : 6 8 3・9 2 . ，ZhuRL，NakayamaM，Ka w a g u c h i K，J i nKL，S t e t l e rRA，SimonRP ，G r ahamSH( 19 9 6 ) ChenJ 白 s i o noft h ea p o p t o s i se 仔e c t o rg e n e，b a x，i sup・r e g u l a t e di nv u l n e r a b l eh i p p 即位n 抑 1CA 1n e u r o n s Expr f o l l o w i n gg l o b a li s c h e m i a .JNeurochem6 7 : 6 4 ・7 1 D a v i e sJC( 19 9 5 )百l eB c l 2f a r 凶l yo fp r o t e i n s，加 dt h er e g u l a t i o no fc e l ls u r v i v a l .T r e n d sN e u r o s c i 1 8 : 3 5 5 3 5 8 o n s a t t e lJ ，p HuangZ，MoskowitzM A(1997)Strain-relateddi百erencesin F u j i iM，HaraH，MengW，V - 1 9 1 - s u s c e p t i b i l i t y何回n s i e n tf o r e b r a i ni s c h e m i ai nSV ・1 2 9andC57Blackl6m i c e .S t r o k e2 8 : 1 8 0 5 ・1 1 . K i r i n oT，T s u j i t aY，TamuraA ( 19 9 1 )I n d u 田 dt o l e r a n c et oi s c h e m i ai ng e r b i lh i p p 田 a mpaln e u r o n s .J CerebBloodF l owMetab1 1: 2 9 9 ・3 0 7 . K i t a k a w a， K MatsumotoM， T a g a y aM，H a t aR，UedaH，N i i n o b eM，H叩 d aN，FukunagaR，K imuraK， Mikoshiba K，KamadaT ( 1卯 0 )“ I s c h e m i ct o l e r a n c e " pbenomenonf o u n di nt h eb r a i n .B r a i n Res 5 2 8 : 2 1 2 4 . Kr a j e w s k iS .MaiJK，胎a j e w s k aM.S i k o r s k aM ， MossakowskiM，ReedJC( 19 9 のUpregulationofbax p r o t e i nl e v e l si nn e u r o n sf o l l o w i n gc e r e b r a li s c h e m i a .JN e u r o s c i1 5 : 6 36 4 6376 Kr開質問 G( 1 9 9 7 )百t ep r o t c ト叩c o g e n eb c l 2andi t sr o l ei nr e g u l a t i n ga p o p t o s i s .N a t u r eMed3 : 6 1 4620 戸 I . . . e BrunDP .WamkeRA，CI e a r yM L( 19 9 3 )E x p r l 邸 s i o no fb c l 2i nf e t a lt i s s u 田 s u g g e s t sar o l ei n mo 甲h o g e n e s i s .AmJP a t b o l1 4 2 : 7 4 5 7 5 3 s01，Hic k e yW F ，KorsmeyerSJ( 19 9 4 )B c l ・2p r o 包i ne x p r e s s i o ni sw i d e s p r e a di n出e MenyDE，弛i d u l tPNS.De v e l o p m e n t1 3 0 : 3 0 1 3 1 1 d e v e l o p i n gn e r v o u ss y s t e mandr e t a i n e di ntbea NovackDV ，K o r s m e y e r sS J( 1 9 9 4 )Bc I 2p r o t e i ne x p r e s s i o nd u r i n gmuri田 d e v e l o p m e n t .AmJP a t b o l 1 4 5 : 6 1・73 O l t v a iZN， Mi I l imanCL ，KorsmeyerSJ( 19 9 3 )Bc I2h e t e r o d i m ぽi z e si nv i v ow i由 acon田 r v e dhomolog， Bax，白紙 a c c e l e r a t e sprogrammedc e l ld e a t b .C e l l7 4 :609-619 HoshimaruM，UemuraY，K i k u c h iH， HashimotoN ( 1 9 9 8 )C o n s i s t e n ti n j u r yi n T e r a s h i m aT，NamuraS， ea f t e r信組s i e n tb i l a t e r a lcommonc a r o t i da r t e r yo c c l u s i o n .N e u r o s u r g e r y t h es t r i a t u mo fC57BU6凶 c 0 0 8 . 4 3 : 90 ，J a f f eE，Cr o c eC M( 1 9 8 5 )I n v o l v e m e n to f曲 eb c l 2g e n ei nhumanf o l l i c u l a r T s u j i m o t oY，CossmanJ lymphoma.S c i e n c e2 2 8 : 1 4 4 0 3 ， CoryS， Adams1M( 1 9 8 8 )B c l 2g l 田 e promoωsh 揖 m o p o i e t i cc e l ls u r v i v a la r 叫c ∞p釘 a t 白 w i t h VauxDL 4 4 0 4 4 2 c-myct oi m m o r t a l i z ep r e Bc e l l s .N a t u r e3 3 5 : WuCR ， zbanR， ZQ iSH，F吋iharaH，Taga， KS h i m o j iK ( 2 0 0 1 )A f o r e b r a i ni s c h e m i cp r e c o n d i t i o n i n g modele s t a b l i s h e di nC57Blac k 1 C 1 j6m i c e .JN e u r o s c iMeth1 0 7 : l 0 1・106 rsm 句e rSJ( 1 9 9 6 )M o l e c u l a rt h a n a t o p s i s :ad i 民 Oぽ s eon出 eb c l ・2f : 祖国l yar 凶 c e l ld田 t b . Y回 gE，Ko Blood8 8 :38 6 4 0 1 i t a k a w aK， M a t s u s h i 也氏 MabuchiT， Y a g i t aY，Y a n a g i h a r aT， MatsumotoM ( 19 9 7 )C57BU6 YangG，K 崎直i ni smosts u s c e p 曲 l et o回 r e b r a li s c h e m i af o l l o w i n gb i l a t e r a lcommonc a r o t i do c c l u s i o n包 nong関 ven mou田 s t r a i n s :s e l e c t i v en e u r o n a ld e a t bi n偽emuri田信組s i e n tf o r e b r a i ni s c h e m i a .B r a i nRes7 5 2 : 2 0 9 ・1 8 . - 1 9 2 -