GlycoStationTM 生細胞表面の糖鎖 3 Technical Information 細胞を破砕せず、細胞表面のグライコームを測定ＧＰＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ CHO 細胞と Lec1 変異細胞の生細胞グライコームプロファイリングゲノム、プロテオームと同様に、生体が持つ糖鎖の全体像はグライコームと呼ばれています。そして細胞はその種類や分化度、変異によって、細胞表面に発現しているグライコームが変わることが知られています。当社のシステムでは、細胞のライセートや分画したタンパク質を蛍光標識して糖鎖解析を行うのが通常ですが、細胞内に取り込まれると代謝的に蛍光を発する試薬（CMRA 試薬）で標識した生細胞をそのまま測定に用いることで、生細胞の細胞表面に発現している糖鎖を解析することも出来ます。この測定法は生細胞表面に発現している糖タンパク質、糖脂質を含んだグライコームプロファイリングのための画期的な手法であるといえます。（Fig.1）ここでは、レクチンマイクロアレイを用いた CHO 細胞とその GlcNAc 転移酵素Ⅰノックアウトである Lec1 変異細胞の糖鎖プロファイリングについて示します。2 種の生細胞に CMRA 試薬を取り込ませることで蛍光標識を行い、レクチンマイクロアレイを用いてそのシグナルの違いを明瞭に検出することができました。 CMRA⹜⮎ ♧㎮ ♧㎮䉺䊮䊌䉪⾰ ⚦⢩ 䊧䉪䉼䊮䊥䊮⢽⾰䊷⚦⢩⤑䊷䊷䊧䉪䉼䊮䉝䊧䉟䊷 Fig. 1 生細胞グライコームプロファイリング ◆ レクチンアレイ画像と細胞の結合の様子 CHO Lec1 細胞レクチンスポット Fig. 2 蛍光測定画像 Fig. 3 顕微鏡写真 GlcNAc 転移酵素 I（GlcNAc-transferase-I) は、複合型糖鎖合成のコア構造の 1-3 アームへの GlcNAc 残基の結合に働きます。したがって、GlcNAc-TI が欠損している Lec1 変異細胞では、複合型糖鎖の合成が進まなくなり、ハイマンノース型糖鎖の発現率が上がるといった N 結合型糖鎖合成の変化が予測されます。実際に測定を行なったところ、蛍光測定画像（Fig.2）に明らかなシグナルパターンの違いが確認されました。また、細胞を壊さずに測定するため、レクチンスポットに結合した細胞の様子は顕微鏡でも観察が可能です。（Fig.3） GlycoStationTM Technical Information 03 ◆ レクチンシグナルの特徴的な差異㪉㪌㪇㪚㪟㪦㪣㪼㪺㪈㪥㫆㫉㫄㪸㫃㫀㫑㪼㪻㩷㪠㫅㫋㪼㫅㫊㫀㫋㫐㪉㪇㪇㪈㪌㪇㪈㪇㪇 4 branched branched N N-glycan -glycan 2 branched branched N-glycan N-glycan bisecting bisecting GlcNAc GlcNAc ǩ1,2-Gal : Fuc Mannose Mannose : Man : GlcNAc 㪮㪞㪘㪞㪪㪣㪶㪠㪶㪘㪋㪞㪪㪣㪶㪠㪶㪙㪋㪛㪙㪘㪪㪙㪘㪪㪙㪘㪚㪸㫃㫊㪼㫇㪸㪚㪸㫃㫊㪼㫇㪸㪧㪫㪣㪶㪠㪤㪘㪟㪧㪥㪘㪮㪝㪘㪮㪝㪘㪘㪚㪘㪤㪧㪘㪟㪧㪘㪟㪧㪘㪭㪭㪘㪘㪙㪘㪣㪜㪣㪪㪫㪣㪬㪛㪘㪧㪮㪤㪧㪮㪤㪡㪸㪺㪸㫃㫀㫅㪘㪚㪞㪘㪚㪞㪫㫏㪣㪚㪶㪠㪫㫏㪣㪚㪶㪠㪙㪧㪣㪙㪧㪣㪫㪡㪘㪄㪠㪠㪫㪡㪘㪄㪠㪠㪜㪜㪣㪛㪪㪘㪞㪪㪣㪄㪠㪠㪞㪪㪣㪄㪠㪠㪥㪧㪘㪥㪧㪘㪚㫆㫅㪘㪚㫆㫅㪘㪞㪥㪘㪞㪥㪘㪟㪟㪣㪟㪟㪣㪪㪪㪘㪫㪡㪘㪄㪠㪧㪟㪘㩿㪣㪀㪧㪟㪘㩿㪣㪀㪜㪚㪘㪜㪚㪘㪩㪚㪘㪈㪉㪇㪩㪚㪘㪈㪉㪇㪧㪟㪘㩿㪜㪀㪧㪟㪘㩿㪜㪀㪬㪜㪘㪶㪠㩷㪘㪦㪣㪘㪘㪣㪤㪘㪣㪶㪠㪪㪥㪘㪇㪣㪫㪣㪧㪪㪘㪣㪚㪘㪌㪇 O-glycan O-glycan : Gal : GalNAc : NeuNAc Fig.4 CHO と Lec1 のシグナル比較前述の蛍光測定画像を数値化して解析を行ったところ、主に N 結合型糖鎖認識レクチンのシグナルに明確な差異が確認されました。 Lec1 変異細胞において、分岐した複合型の N 結合型糖鎖認識レクチン（PHA(L), PHA(E), ACG, TxLCⅠ）、ガラクトース認識レクチン（ECA, RCA120）のシグナルは減少し、その一方、ハイマンノース型の N 結合型糖鎖認識レクチン（NPA, ConA, GNA, HHL, PWM, Calsepa）のシグナルは増加しています。Lec1 変異細胞における O 結合型認識レクチンのシグナル差異は、複合型の N 結合型糖鎖の欠如によって O 結合型糖鎖や糖脂質が細胞表面へ露出され、細胞表面の糖鎖の全体像が変化したためであると推測されます。以上の結果は Lec1 変異細胞が糖転移酵素 GlcNAc-TI の欠損であることと合致しています。（Fig.4） - 測定方法 1. 細胞サンプルの回収と分画 Note 1-1. 3×106 個 1) の細胞を測り取り、無血清培地で洗浄します。 1) 1 回以上継代した細胞を用いる。 2) CellTracker™ Orange CMRA 2. 蛍光標識 2-1. 3×106 個の細胞を 300μl の無血清培地で懸濁したところに、1mM の CellTrackerTM 2) を 3μl 加えます。 2-2. 遮光・攪拌しながら 37℃で 15min 反応させます。 2-3. 反応後、1%BSA/PBS で細胞を洗浄し、細胞が染色されていることを確認します。 (Invitrogen, Cat#:C34551) DMSO で 1mM に調製したものを終濃度 10mM で使用する。 3) LecChip™ (GP Bio Sciences) 4) Probing Solution (GP Bio 3. レクチンマイクロアレイの測定 3-1. 染色した細胞を、1%BSA/PBS で目的の細胞数になるよう希釈します。。 3-2. LecChipTM 3) を Probing Solution4) で 3 回洗浄後、サンプルをアプライします（100μl / well） 3-3. 4℃で 30min 反応させます。 3-4. PBS で満たした 50ml チューブに反応後の LecChipTM を入れ、反応槽側を下にして 30min 静置させることでレクチンと結合していない細胞をアレイから外します。 Sciences) 5) GlycoStation™ Reader 1200 (GP Bio Sciences) 6) GlycoStation™ Tools Pro Suite (GP Bio Sciences) 3-5. PBS が入った状態で LecChipTM を GlycoStationTM Reader 12005) で測定します。 3-6. GlycoStationTM Tools Pro Suite6) で解析します。株式会社ＧＰバイオサイエンス京浜事業所 : 〒225-0012 神奈川県横浜市青葉区あざみ野南 1-3-3 http://www.gpbio.jp Tel: 045-913-5803 Fax: 045-511-8570 Mail: [email protected]