Opal FAQ 電子レンジ処理について 1000W の電子レンジがありません。電子レンジに出力調整機能がありません。沸騰するまで時間が掛かりますが、750W, 600W など一般家庭用のレンジを使用できます。 Opal のマニュアルでは染色手順を出力調整可能な 1000W 電子レンジを基準としています(Step2 および Step7)。これ以外の出力の電子レンジ、出力調整機能を持たない電子レンジを用いた場合の処理条件は以下を参考に決定できます。 1) スライドを容器に入れクエン酸緩衝液で浸し、密閉しないように蓋をします。 2) 容器を電子レンジに入れ、溶液が沸騰するまで連続してレンジに掛けます。 3) 沸騰し始めたら一度レンジを止めます。 4) 再度レンジのスイッチを入れ、沸騰するまでレンジに掛けます。 5) 沸騰し始めたら再度レンジを止めます。 6) 以降、レンジの再開・停止を、初回の沸騰後の延べ時間が 15 分になるまで繰り返します。 7) 容器が室温程度に冷めるまで放置します。 8) 水または緩衝液により洗浄します。電子レンジの代わりにホットバスは使用できるか電子レンジの代わりに圧力釜タイプのジャーを使用できるか。電子レンジ処理により標本が脱落することはないか。 ● 繰り返しレンジ処理している間における溶液温度を沸点に近く保つことにより抗体を変性除去します。 ● 湯浴のように温度調整可能な器具を用いる場合は 95 度、15 分などを開始条件として、抗体除去条件を検討ください。 ● 抗体の除去状況は、二色目、三色目の TSA 試薬を添加し顕微鏡観察することで確認できます。キットインサート 4 ページ、枠囲み内もご参照ください。抗体を変性除去できる温度まで十分に加熱できれば使用可能です。加熱時間、条件については装置に合わせて事前に確認・検討してください（抗体の除去の確認は別項目を参照）。使用可能です。加熱時間、条件については装置に合わせて事前に確認・検討してください（抗体の除去の確認は別項目を参照）。貼り付け方が弱いときには起こり得ます。固定した凍結切片では、スライドグラスをポリリジンコートすることで、電子レンジ処理してもサンプルが良好にスライドグラスに保持されたとのユーザーの報告があります。 1/3 株式会社パーキンエルマージャパン Opal FAQ 電子レンジ処理により蛍光色素が退色することはないか。電子レンジ処理により抗原性は失われないか。一定の退色はあると考えられます。しかしながら多くのユーザーさんの間で加熱処理による退色が観察の支障になったという事例は、これまでのところ伺っておりません。TSA Plus による蛍光色素の集積が良い方向に働いている可能性もあります。熱処理により抗原性に影響を受けることが分かっているタンパク質を対象とする場合は、そのタンパク質から染色していただくことで熱処理の影響を最小限に留めます。標本・サンプルについて凍結切片で使用できるか。凍結切片は固定すべきか。凍結切片は電子レンジ処理できるか。凍結切片の場合、脱パラフィン処理は必要か。培養細胞で使用可能か。ガラスディッシュ・チャンバースライドに培養した細胞で使用可能か。原法を記載している論文では凍結切片を対象としているので使用は可能です。手順に関して条件検討は必要です。 4% パラフォルムアルデヒド固定またはエタノール/アセトン固定で良好な結果が得られたとのユーザーからの報告はあります。処理時間の検討は必要ですが、固定した凍結切片での成功事例があります。脱パラフィン処理は不要ですが、内在性のペルオキシダーゼ活性を不活性化する処理（過酸化水素処理）は必須です。初めのブロッキングを始める前に行ってください。標本が熱処理に耐えないと思われるので使用できないと考えます。標本が熱処理に耐えないと思われるので使用できないと考えます。染色操作について染色する順番に決まりはあるか。既に TSA が結合した部分の近傍にあるタンパクを続けて染色する場合、チラミドの結合部位となるチロシン残基が既に支配的に先行する色素のチラミドに結合していて染色の妨げとなることは無いか。染色のコントロールはどのようにとるか、抗体除去の確認方法は。ペルオキシダーゼ活性を不活性化処理は必要か。特にありません。チラミドの結合は抗原タンパク質だけでなく周辺タンパクのチラミドにまで及びますが、生体は数多くのタンパク質から構成されていることから全てのタンパク質に対して支配的に特定のチラミドが結合する状況は起こりにくいと考えます。またこのような状況が支障となったとのユーザーの報告はこれまでのところありません。抗体が十分に除去されているかは、電子レンジ（熱）処理後、一次抗体無しで、二次抗体と二色目の TSA の発色反応行うことで確認できます。一次抗体無しで蛍光が発色するようであれば処理が不十分なので、処理時間の延長などの検討が必要です。必要です。提供しているプロトコルでは染色前の脱パラフィン処理がペルオキシダーゼ活性の不活性化処理を兼ねておりますが、ペルオキシダーゼ活性が強いサンプルの場合、過酸化水素水処理を追加してください。 2/3 株式会社パーキンエルマージャパン Opal FAQ TSA 全般について活性化チラミドの拡散により空間分解能が低下するのではないか。法規制化合物は含まれるか。ブロッキング試薬は何を使えばよいか。抗原と標識化合物の組み合わせの推奨はあるか。観察にはマルチスペクトルイメージングシステム(Vectra, Mantra, Nuance)が必要か。 HRP により生成する活性酸素（ラジカル）の拡散範囲は概ね 200 nm であると考えられています。これはおおよそ IgG 抗体 2 つ分の長さに相当するため、光学顕微鏡の解像度における観察において分解能の低下として認識できるほどの拡散距離ではないと考えます。 MSDS 対象です。PKJ のホームページから入手可能です。使用する一次抗体、二次抗体に適したブロッキング剤を使用してください。特にありませんが、存在量が少ない抗原について Cyanine 5 のように長波長の色素を使用いただくと、観察時にバックグラウンドとのコントラスを得やすくなります。 Opal キットの色素の基本構成(Fluorescein, Cyanine 3, Cyanine 5)であれば、通常の蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察が可能です。 3/3 株式会社パーキンエルマージャパン