N型糖タンパク質糖鎖のコア構造の 型糖タンパク質糖鎖のコア構造の 効率的生産技術の開発 新潟大学 農学部 応用生物化学科 特定研究員 仁平 高則 1 糖鎖・複合糖鎖 糖鎖 各種単糖類（グルコース，ガラクトース，マンノース， N-アセチルグルコサミン，フコース，シアル酸など）が グルコシド結合で連なった一群の化合物。 結合様式，重合度，構成糖による構造多様性に 起因する機能性，分子認識性を有する。 複合糖鎖 タンパク質や脂質などに糖鎖が結合した化合物で， それぞれ糖タンパク質や糖脂質などと呼ばれる。 N 型糖鎖，O 型糖鎖，糖脂質，GPIアンカー，プロテ オグリカン，ペプチドグリカン，リポ多糖，S層糖タン パク質，莢膜多糖など 細胞分化、老化、免疫応答など生命現象 病原体による宿主認識、癌転移、炎症などの疾患に深く関与 2 アスパラギン結合型糖鎖 アスパラギン結合型糖鎖 N 型糖鎖の構造 細胞接着 免疫調整 シグナル伝達 糖タンパク質の安定性・溶解性 β β コア構造 マンノース GlcNAc ガラクトース シアル酸 β-1,4-Mannosyl-N,N’-diacetylchitobiose HO HO OH OH O OH NHAc O HO O O HO O NHAc OH OH 62,000 円 / 10 μg （ProZyme Inc.） 糖鎖およびそのコア構造を安価に 生産できれば，医薬品素材として 有効 3 従来技術とその問題点 （1）有機合成 ○多様な構造に 対応 保護 合成 ×β-マンノシドなど 合成困難 脱保護 ×多段階反応 ○厳密な位置選択性 ○重合度制御 （2）糖転移酵素 NDP NDP ×酵素，糖ヌクレオ チドが不安定 （３）加リン酸分解酵素（ホスホリラーゼ） 4 ホスホリラーゼ ホスホリラーゼ ＋ オリゴ糖 P リン酸 P 糖1リン酸 ＋ 単糖 可逆反応 厳密な位置選択性 オリゴ糖生産に有効 ホスホリラーゼによる 高純度のオリゴ糖生産 還元末端側の糖の変更に よるオリゴ糖の多様性増大 5 β-マンノシドホスホリラーゼの探索 マンノシドホスホリラーゼの探索 BT_1033 322AA 18% R. albus ManGlcP 386AA 56% 58% 335AA R. albus 1,4-β-Mann P 390AA B. fragilis ManGlcP ManGlcP: Mannosylglucose phosphorylase 1,4-β-Mann P: Mannooligosaccharide phosphorylase amnA phoA mfsT nahA nanH pufA enhA susD susC B. thetaiotaomicron ? 1038 1033 1032 1035 1036 マンノース ガラクトース 1032 1033 1034 1035 1036 1037 1038 1039 1040 GlcNAc シアル酸 amn： α-Mannosidase pho： GH130 Phosphorylase mfsT： Major facilitator superfamily transporter nah： β-N-Acetylhexosaminidase nanH： α-Sialidase enh： Endo-β-N-Acetyl-glucosaminidase sus： Sus(Starch utilization system)-like system 6 β-マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見 マンノシドに作用するホスホリラーゼの発見 HO HO HO OH O Man1P GlcNAc + R OH O O P OO- Activity of BT_1033 Km (mM) ROH GlcNAc HO HO HO OH O OR + O HO P O O- GlcNAc 2 3.8 27 kcat (s-1) kcat/Km (mM-1s-1) 37 9.6 22 0.8 反応生成物 β-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase NMR ManGlcNAc Pi α-Mannosyl 1-phosphate GlcNAc Nihira et al., J. Biol. Chem., 288, 27366 (2013). 7 Ｎ 型糖鎖コア構造の生産法の開発 新規酵素4-O-β-D-mannosyl-N-acetyl-D-glucosamine phosphorylaseの発見 Synthesis αマンノース1-リン酸 β-1,41,4-マンノシルN マンノシルNアセチルグルコサミン N-アセチルグルコサミン Synthesis HO HO OH OH O O N,N’-ジアセチルキトビオース OH NHAc HO O OH αマンノース1-リン酸 リン酸 O HO O OH NHAc β-1,4-マンノシル- N,N’ -ジアセチルキトビオース リン酸 N,N’-diacetylchitobiose Core trisacchride of N-linked sugar chain 1 g・・・ ¥620,000,000 β-1,4-Mannosyl-N,N’diacetylchitobiose 60 min 10 min 0 min standard Retention time（min） 8 ホスホリラーゼによる生産法の問題点 β-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase + + α-Man1P GlcNAc ManGlcNAc Pi 糖1リン酸が高価 （αMan1P : 834,000円/g） 安価な天然糖質からホスホリラーゼおよび 各種酵素を用いて糖1リン酸を獲得する 9 ホスホリラーゼによるオリゴ糖生産システム 糖1リン酸をつくる ホスホリラーゼ 安価な糖質 Pi 糖1リン酸 Pi リン酸 変換 可能ならば 変換・利用 Pi ホスホリラーゼ オリゴ糖 オリゴ糖をつくる 糖受容体 10 糖1リン酸の生産および変換 麦芽糖 澱粉 ショ糖 GP SP MP αGlc1P α-PGM GalT GalE Glc6P β-PGM G6PI βGlc1P β-グルコシドの合成 M6PI αGal1P β-ガラクトシドの合成 PMM α-グルコシドの合成 αMan1P β-マンノシドの合成 MP: maltose phosphorylase, SP: sucrose phosphorylase, GP: glycogen phosphorylase, PGM: phosphoglucomutase, G6PI: glucose 6-phosphate isomerase, M6PI: mannose 6-phosphate isomerase, PMM: phosphomannomutase 11 ManGlcNAcの調製（ショ糖出発） ManGlcNAcの調製（ショ糖出発） α-ホスホ P P グルコムターゼ スクロース ホスホリラーゼ αGlc1P αGlc1P ショ糖 Glc6P Glc6P Glc6P イソメラーゼ P P Fru Fru6P Fru6P Man6P イソメラーゼ GlcNAc P P ManGlcNAc ManGlcNAc P αMan1P αMan1P ホスホ Man6P Man6P マンノムターゼ *ManGlcNAcP: β-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine phosphorylase *ManGlcNAc: β-1,4-Mannosyl N-acetyl glucosamine 12 ManGlcNAcの調製（ショ糖出発） ManGlcNAcの調製（ショ糖出発） 250 mM 250 mM 10 mM 100 mM 20 μg/mL 33 μg/mL 340 μg/mL 370 μg/mL 230 μg/mL 2.4 mg/mL 83 μg/mL ショ糖 N-アセチルグルコサミン MgCl2 リン酸ナトリウム グルコース1,6-ビスリン酸 スクロースホスホリラーゼ α-ホスホグルコムターゼ グルコース6-リン酸イソメラーゼ マンノース6-リン酸イソメラーゼ ホスホマンノムターゼ ManGlcNAc ホスホリラーゼ Fructose Sucrose ManGlcNAc 30℃ 収率42％で合成 0 2 4 6 8 Suc 1 3 5 7 Fru Time (day) MGN 13 新技術の特徴・従来技術との比較 •従来技術では合成困難なβ-マンノシドを，簡便 に生産することに成功した。 •従来の合成法では，有機溶媒の使用やスケール アップの点で生成糖の用途が限られていたが， One-pot酵素合成法により安全性を担保した大量 生産が可能となった。 14 想定される用途 •安全性の高い医薬品の原材料としての用途 をはじめ，医療分野全般，食品分野，化粧 品分野などへの利用が想定される。 •具体的には，疾病用のマーカー，iPSやES細 胞の分化後の識別用マーカー，癌細胞や病 原菌の除去フィルター，ドラッグデリバ リーシステム，免疫寛容を組み込んだ糖タ ンパク質製剤としての利用など。 15 実用化に向けた課題 •出発材料にショ糖を用いた生産システムを開発 したが，廃糖蜜などの廃棄物を利用した更なる 低コスト化が可能か検討する必要がある。 •水酸基を修飾した糖を使用した実験データを取 得し，有機合成法と連携をとる場合の条件設定 を行なっていく。 •食品利用の場合，微生物汚染防止の観点から 60℃程度の高温反応が望まれるため，耐熱性 酵素の探索が必要である。 16 企業への期待 •有機合成法，糖転移酵素による合成法など， 従来の技術をもつ医薬品分野の企業で，本技 術で生産されるマンノシドを材料とできる企業 •食品分野の企業で廃棄物（廃糖蜜など）利用を 展開を考えている企業 •キチンオリゴ糖生産技術をもつ水産加工系企業 で，糖鎖合成分野への展開を考えている企業 などで，本技術が有効と考えられ， 共同研究・開発を希望する。 17 本技術に関する知的財産権 •発明の名称： オリゴ糖合成酵素およびアスパラギン 結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の 製造方法 •出願番号： 特開2014-045704 新潟大学，農研機構食品総合研究所 •出願人： 中井博之，仁平高則，鈴木絵里香， •発明者： 大坪研一，北岡本光 他，未公開特許1件 18 お問い合わせ先 新潟大学 産学地域連携推進機構 産学地域連携推進センター ＴＥＬ ０２５－２６２ －７５５４ ＦＡＸ ０２５－２６２ －７５１３ e-mail [email protected] 19
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