花からのSaccharomyces cerevisiaeの選択的分離と遺伝的多様性誌名日本食品科学工学会誌 ISSN 1341027X 著者安田, 庄子北本, 則行巻/号 58巻9号掲載ページ p. 433-439 発行年月 2011年9月農林水産省農林水産技術会議事務局筑波事務所 Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat (31) l5 8，No.9，433~439 ( 2 0 1 1 )C 技術論文〕 NipponShokuhinKagakuKogakuKaishiVo. 433 花からの S αc c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eの選択的分離と遺伝的多様性安田(吉野)庄子*北本則行愛知県産業研究所食品工業技術センタ SelectiveIsolationofS α cch αror . n ycescerevisi αeStrains fromFlowersandTheirGeneticDiversity ShokoYoshino-Yasuda*andNoriyukiKitamoto FoodResearchCenter，A i c h il n d u s t r i a lTechnologyl n s t i t u t e， 2-1 -1Shimpukuji-cho，N i s h i k u，Nagoy ，且A i c h i4 5 1-0 0 8 3 New i s o l a t e so fS αc c hα γo myces c e r e v i s i αe from n a t u r a lh a b i t a t sa r巴 needed i n ord巴rt og i v e new c h a r a c t e r i s t i c st ofermented f o o d ssucha sa l c o h o l i cbeveragesandb r e a d s . Althoughmanyattcmptst o e r e v i s i a es t r a i n sfromf l o w e r sandf r u i t shaveb巴巴 nmadei nJapan，t h e r ea r ef 巴ws ucc巴s s f u lr c p o r t s i s o l a t eS .c er e s u l t si n d i c a t et h a t丘ne f f i c i e n tm巴thodo fi s o l a t i n gS .c e r e v i s i a eshouldb巴 d巴v e l o p e d . Thereforc，we Th巴s ni s o l a t i n gs e l e c t i v es t r a i n so fS .c e r e v i s i αefrom f i o w e r si nA i c h ip r e f e c t u r 巴 b ya t r i巴dand succ巴ededi u l t u r i n gandPCRa n a l y s i so ft h erDNA5 . 8 S I T Sr e g i o n .S i xs t r a i n so f combinationo fs e l e c t i v e巴nrichmcntc e r e v i s i a e were s u c c e s s f u l l yi s o l a t e d，and t h e i r ferm巴n t a t i o nand sugar a s s i m i l a t i o np r o p e r t i e s were S .c . Ferm巴n t a t i o nand sugar a s s i m i l a t i o np r o f i l e s were i d e n t i c a l among f i v ei s o l a t e s，but was determin巴d e n ti nonei s o l a t e . Thesugara s s i m i l a t i o np r o f i l c so fa l ls i xi s o l a t e swered i f f e r e n tfromt h o s eo ft h eS d i f f巴r c e r e v i s i a eK7usedi ns αke-brewingandt h eS .c e r e v i s i a eByusedi nb r巴ad-making.Theyd i dnotproduc巴 any k i l l e rt o x i n sa g a i n s tK7and B y . The mtDNA RFLPa n a l y s i so ft h cs i xi s o l a t c sshowed ahighl e v e lo f d e n t i c a lp a t t e r n s wer 巴 f oundf o rtwoi s o l a t e s . PCR a n a l y s i so ft h eTyl d e l t a polymorphism，althoughi elementr e v e a l e dt h a tbotht h enumberandt h es i z eo ft h ea m p l i f i c a t i o nproductsd i f f e r e damongt h es i x y . Thes巴 r e s u l t sshowedg巴n巴t i cd i v e r s i t yamongt h es i xS .c e r e v i s i a ei s o l a t e s i s o l a t e s，K7andB e i v e dApr .1 9，2 0 1 1;Accept巴dJ u n .1 6，2 0 11 ) ( R巴c Keywords:α Sc c h γ αo m y c e sc e r e v i s i a e ，s e l e c t i v ci s o l a t i o n，g e n e t i cd i v e r s i t y キーワード S a c c h a r o m y c e sc eγe V l s l ω，選択的分郁，遺伝的多核性 e r e v i s i a eは酒類・ノ f ンなどの発酵母 Saccharomycesc .c e r e m S l仰の分離が試みられていどを試料として S しかし，分離には多くの時間と労力が費やされて酵食品の製造に使用されている大変重要な産業微生物であるiトi) る現在利用されている S .c e r e v i s i a eの多くは優れた品質いるにもかかわらず，分離に成功した例は 1 0例程度と少の発酵食品から分離された菌株である.例えば，清酒用酵ない.このことは，自然環境 I~] で S. c e r e v i s i a eが希少であ母は優良なもろみから分離された優れた醸造特性を有するることも要因のーっと考えられるが，選抜方法，すなわち S .c e r e v i s i ω であり，協会￨酵母として(財)日本醸造協会麹汁培地等による集積培養とS. c e r e v i s i a eの検出方法にから頒布されている. これらの優良菌株の利用は製品の品改良の余地があることを示唆している . そこで Sacch α - 質向上 l こ大きく貢献してきた. しかし，食生活の多様化に romyces属酵母の生態学的研究における分離方法について伴って様々な噌好に対比、する発酵食品の製造が求められ，調査したところ，異なった生理学的性質をもっ新たな S .c e r e v i s i αG が必要広葉樹林の樹皮や土壌などの 8 4試料からS. c e r e V l s w eお Sniegowskiらは，集積培養により北米とされている. また，地域特産品としての酒類・ノマンの開よび Saccharomycesparadoxusを計 1 8株分離したことを発を目的として，地域の観光資源，例えば製品に好印象を報告しているの.また Sampaioらは，ポルトガルの広葉樹付与できる花や果実などを分離源とした新たな S . e r e v i s i a e，S .paradoxus ，Sacch α 林の樹皮 1 4 7試料から S .c c e r e v i s i a eが求められている. romycesuvarum，S αc c hαromycesk u d r i a v z e v i iを計 5 3朱 { このような背景から，近年，日本全国各地で花や果実な干4 5 10 0 8 3愛知県名古屋市西区新宿寺町 2 1 1 *連絡先 ( C o r r e s p o n d i n ga u t h o r )，s h i y o u k o _y a s u d a @ p r e f . a i c hi . lg . j p と多数分離したことを報缶しているの. これらの知見から，樹皮試料からの Saccharomyces属酵母の分離に用いられた選択培地を使用することによって，花や果実などからも (3 2) 日本食品科学工学会誌第 58巻第 9 号 2 0 1 1 年 9月 4 3 4 S αc c h a r o m y c e s属酵母をより効率よく分離できると考え内訳は，サクラが 6 5本，フジが 1 6本，アジサイが 10*，られたスイセン，ショウフ， e r e vi s i a eによる酒類・バン類の製造我々は，新規の S .c ツツジなど燦々な花がそれぞれ 1~3 本で合計 3 9本であった. 白濁や白色沈殿が見られた培養を最終的な目標として，愛知県内の花から複数の s . 液の一部を採り，滅菌生理食塩水で適宜希釈して PDA培 c e r e v l s z a eを分離することを目指した. そこでまず，地Lヒでシングルコロニーイじした . Sampaioらが使用した培地に基づいた選択増殖培地 (RE RE培地から分離した酵母の rDNA5 . 8 S I T S領域(ITS αc charomy c e s属酔培地)中で，花を試料とした場合にも S 1 ・ 5 . 8 S-ITS2) の増幅は母が選択的に増殖することを確かめるために，花から分離じて以下のように行った. 9 5Cで 1 0分間加熱処理した酵 Esteve-Zarzosoらの方法 10)に準 0 した様々な酵母の RE培地における生育を調べた.続いて母試験菌株の牒濁被を鋳型 DNAとし，プライマー ITS1 RE培地による選択増嫡培養と rDNA 5.8S-ITS領域の ( 5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') および ITS4 ( 5 ' - PCR解析を組み合わせることにより， S .c e r e v i s i a eの迅速 TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(終濃度各 0 . 5ぃ M)と，な分離を試みた.また，得られた分離株について生理学的 PCR用酵素 QIAGENFastCyclingPCRK i t (QIAGEN) 試験と遺伝的多様性解析を行ったので報告する. を用いて PCRを行った 0 0 ， PCRの温度条件は， 9 5C5分 0 4 0サイクノレの 9 6C5秒 ;5 5C5秒 ;6 80C2 7秒， 7 20C 1分実験方法とした反応物の 2%Cw/v)アガロースゲル電気泳動を行ーい， rDNA5 . 8 S I T S領域の増幅長が 880bpである分離酵 1 . 使用菌株および培地花から Y M培地(酵母エキス 0.3% (w/v)，麦芽エキス accharomyces属酵母の候補株として選抜した. 母を S 0 . 3% (w/ v )，ペプトン 0 . 5% (w/v)，グルコース 1 % (w/v)， 4 . 268rDNAD1/D2領域の塩基配列による酵母の同定クロラムフェエコール 0.05%(w/v))を用いて分離した酵 j法 1 1) 26SrDNAD1/D2領以の地幅は， Kurtzmanらのプ母，C andidav a c c i n i i ，C r y p t c o c c u sb e s t i o l a e ，H a n s e n i a s ρo r a に準じ， uv αrum，Metschni 1 wωi ak o r e e n si s ，R hodosporidiumρ αl u・ AGGAAAAG-3')および NL-4 ( 5 '-GGTCCGTGTTTC- digenum， P i c h i αg u i l l ie r m o n d i i ， Pseudozyma a p h i d is ， AAGACGG-3') を用いて rDNA5 . 8 S -ITS領域の増幅と閉プライマ-NL-1 C 5 '-GCATATCAATAAGCGG- S c h i z o sαc c h a r o m y c e sj a p o n i c u s， U s t i l a g os ρen η o ρhora， I じ条件で PCRを行った. 得られた DNA断片の塩基配ヲJ T o r u l a s ρo r a_ d e l b r u e cたμ は， RE用地の有効性を調べるたを決定し，決定した塩基配列を NCBIから利用できるめに使用した .清酒用協会酔母 K7株(以下 K7株)および BLASTプログラムリによりホモロジー検索を行い，酵母ニップンドライイースト ( E I本製粉(株)製)から分離したの種を同定した. バン用酵母 By株(以下 By株〉は，対照株として実験に使 5 . S .c e r e v i s i a e分離株の生理学的性質糖の発酵性試験および資化性試験は，後藤らの方法 Il川こ用した. Saccharomyces属酵母の選択地殖培地には， Sampaio ら9)のl 古地にクロラムフェニコーノレを } J日えた RE培地(イーストニトロゲンベース 0 .67% (w/v )，ラフィノス 1% (w/v )，エタノール 8%(v/v) %，クロラムフェニコール準じて以下のように行った.糟の発酵性試験は，培地 ( 糖 2% (w/v) (ラフィノースのみ 4%(w/v))，ポリペプトン 1 % (w/v)，酵母エキス 0.5%(w/v))に酵母試験菌株の麻 0 濁液を培地の 1/1 0 0容量楠闘し， 2 5Cで 71=1間培養して 0 . 05% (w/v)) を使用した.酵母のシング/レコロニー化に夕、ーラム管中のガスを観察した糖の資化性試験は，培地殿粉 0. 4% ( w/ v) ，グルコース 2% は PDA培地(馬鈴薯 t ( 糖 1 .0% Cw/v)，イーストニトロゲンベース 0 . 6 7% ( w/ (w/v)，寒天 1 .5% Cw/v)，クロラムフェニコール O05% v))に酵母試験菌株の鯨濁液を培地の1/1 0 0容量植菌し， (w/ v))を，酵母の全 DNA の調製には YPD培地(酵母エ 2 5Cで 3週間情養して生育の有無を観察した. 目キス 1% (w/v )，ポリペプトン 2% Cw/v )，クノレコース 2% ( w/v) ) をそれぞれ使用した. 2 キラー性試験は，メチレンブルーを 0.003% Cw/ v )添加した YPD寒天平板培地に， K7株または By株を約IOi/枚各種酵母の RE培地での生育試験 RE培地を滅菌済みねじ口中試験管に各 3ml分注し， 0 となるように塗布した後，酵母試験菌株を白金耳で線画塗ヒ抹し， 8時間培養した. 測定菌株の周りにクリア 3 0Cで 4 0 記 1 0種の酵母試験菌株の牒濁i i I < : (l白金針量/ 滅菌生I 虫食ソーンができたものをキラー活性￨場性とした塩水 1ml)を名 30ぃ l植菌して 3 0Cで 71=1間静置法養し株として，キラー 007株 l討を使用した 0 た.培養液に白ぷj や白色沈殿が見られたものを生育￨場性と陽性対照菌 6 . S .c e r e v i s i a e分離株の遺伝的多様性解析ミトコンドリア DNA(mtDNA)RFLP角科斤は， Querol した 3 . 花からの S .c e r e v i s i a eの選択的分離らの方法 1 . ) 1に準じて以下のように行った .YPD培地で培養 1 3 0本の 2 5 0mlメディウム瓶に各 1 0 0mlの RE培地をした酵母菌体から，ザイモリエイス 100T(生化学工業)処調製し，愛知県内の花を滅菌ピンセットで培地に浸る量ま 0 0日間静置培養した .1 3 0本の培養ので採取し， 3 0Cで約 1 理とフェノール・クロロホルム抽出による方法で全 DNA I(TOYOBO) を抽出した.全 DNA約 8μgを制限酵素 Hinf 安田・北本:7 Eからの有用￨酵母の分離と多様性 (33) 435 または制限酵素 RsaI (TOYOBO) を用いて 100ぃ lの反応は 5.8S-ITS領域長が 880bpであることが示されている. 系で消化し，フェノール・クロロホルム抽出およびエタそこで，白濁した RE培地サンプル 1 6本から分離した酵ノール沈殿を行った試料全量を 1% (w/v) アガロースゲ母コロニーについて， PCRにより 5.8S-ITS領域長を解析ル電気泳動(13cmX13cmスラブゲル)に供した. した.各サンプノレにつき 8コロニーずつ 5.8S-ITS領域長 Ty1 de1 taエレメン卜の PCR解析は， Hayfordらの方を解析したところ， 8コロニ一間でそれぞれ同一の長さで法 15)に準じて以下のように行った. 95Cで 1 0分間加熱処あった(データ省略).したがって各サンフ。ルからの分離酵理した酵母試験菌株の将 i f i J液を鋳型 DNAとし， de1 taエレ 6サンフ' ルからの母はそれぞれ単一の酵母と推定された. 1 メントキ寺異的プライマ -d e l t a1 ( 5 '-CAAAATTCACC - 酵母分離株の 5.8S-ITS領域長の PCR解析結果を図 lに示 0 TATA/TTCTCA-3勺および de1 ta2 ( 5ぺGTGGATTT ， NO.66株， NO.71株， NO.90株， No.1 0 1 した. NO.52株 TTATTCCAACA-3') (終濃度各 0 . 5 1 1M) と， PCR用酵素株および No. 122株の 6株において約 880bpの長さのバ QIAGENFastCyclingPCRKit(QIAGEN)を用いて PCR ンドが増幅され，これらの株は 5accharomyces属酵母と 35サイクルの推定された.その他の分離株の増幅バンドは 880bpよりも 96" C5秒 ;45C5秒 ;68C3 0秒， 72C1分で行った. 反応、小さいサイズを示した • 5 acchαromyces属酵母と推定されを行った. PCRの温度条件は， 0 0 0 9 5C5分， 0 物を 2 . 5% (w/ v ) アガロースケソレ電気泳動で解析した. 実験結果および考察 1 . 各種酵母の RE培地での生育試験花試料に対する RE培地の有効性を確認するために，化た 6株の分離源は， NO.52株および NO.66株がサクラ， NO.71株がフジ， NO.90株がノ寸ンジー， No.1 0 1株がアジサイ， No.122株がオシロイパナであった. 1 6株の分縦株について 26SrDNADl/D2領域の塩基配列による酵母の同定を行った， No その結果， NO.52株試料から分離した 1 0種の酵母を試験菌株として生育試験を行った.表 1に示したように， K7株および By株の 2株表 1 花から分離した各種酵母の RE培地における生育の5 .c e r e V l S l a eは共に RE培地中で強い生育を示した.一試験菌株育が認められたが，他の 7種は全く生育を示さなかった. S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eK7 この結果から，採取した花を RE培地に漫潰して培養する S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eBy ことにより，花に存在する酵母種の多くは生育が抑制され C a n d i d av a c c i n i i 5accharomyces属酵母が選択的に増殖する可能性が示唆 C r y p t c o c c u sb e s t i o l a e こ. され f Hanse ηw sporauvarum 2 花からの S .cerevisiaeの選択的分離様々な花を採取してよ百養した 130本の RE培地サンプル 6本に酔母の培殖を示す白色沈殿または白濁が認めら中， 1 れた.これらの 1 6本のサンプルから酵母を分離し，シングレコロニー化した. ，生育結果 +一十方，P .g u i l l i e r m o n d i i .C .v a c c i n i i .土 d e l b r u e c k i iに弱し、生 w M e t s c h n i l wωi ak o r e e n s i s Rh o d o s p o r i d i u mp a l u d i g e n u m P i c h i αg u i l l i e r m o n d i i w Pseudozymaa P h i d i s j rDNAの 5.8S-ITS領域の長さとその RFLP解析(制限 S c h i z o s a c c h a r o m y c e sj a p o n i c l l s 醇素切断長解析)により酵母の種を問定するデータベース U s t i l a g os p e r m o p h o r a 5 . が構築されており川，その中で 5accharomyces属酵母 ( T o r u l a s p oγad e l b r u e c k i i b a y a n u s .5 .c e r e v i s i a e .5ρ αradoxusおよび 5 .p a s t o r i αnus) w +. 生育; W.わずかに生育，一，生育せず図 1 酵母分離株の rDNA5 . 8 S I T S領域長の PCR解析 t v l . 2 L o gDNALadder ( NEWENGLANDB i o L a b s );1 .K7株; 2 .By株;3 .N o .1株;4 .N o .6株 5 .N o .1 9 株;6 .N o .4 9株;7 .N o .5 1株;8 .N o .5 2株;9 .N o .6 4株; 1 0 .N o .6 6株 1 1 .N o .7 1株; 1 2 .N o .7 2株 1 3 .No 7 3株 1 4 .N o .7 5株; 1 5 .N o .7 7株 1 6 .N o .9 0株; 1 7 .N o .1 0 1株 1 8 .N o .1 2 2株. 日本食品科学工学会誌第 58 巻 436 第 9号 (34) 2011 年 9 月， No.71株， No.90株， No.1 0 1株および No.122株 66株は 3株だけであったり.これらの報告に比べると， RE培地の 6株のDl/D2領域の塩基配列はS.c e r e v i s i a eの配列とを用いた選択増殖培養と rDNA5.8S-ITS領域の PCR解析 1 0 0% 一致し，これら 6株は s .cerevisiaeと同定された .s c e r e v is i a e以外の 1 0株の分離株は， C .v a c c i n i i(No.1株 ) ，による分離方法は， S .c e r e v i s i a eを大変効率良く分離できる有用な方法である. P i c h i aanomαJα(No.5 1株 ) ， P i c h i af a b i a n i i(No.72株)，表 lに示した花から分離した各種酵母の中にはラフィ P i c h i af a r i n o s a(No.1 9株 ) ， P .g u i l l i e r m o n di i(No.6株，ノース資化能を有する酵母が含まれていたが(データ省 NO.64株， No.75株 ) ， P i c h i akudγ ωv z e v i i (No.49株)，略 ) ， RE培地中では生育しなかった. このことから， RE T .d e L bγu e c k i i(No.73株， No.77株)とそれぞれ同定され培地を使用することによって S .c e r e vi s i a eが効率的に分た Sampaioらは広葉樹のナラの樹皮を試料として RE 離できる主な要因は， 8%エタノーノレを培地に添加してい培地により酵母の分離を試みたところ，S accharomyces属ることであると推察している .高いエタノール発酵能を有以外の酵母は稀にしか分離されず，分離された中ではする S .c e r e v i s i a eは 8%エタノール存在下でも十分増殖 KL u y ve r omyces t h e r mo t ol e r a n sと To r ul a s ρo r α ，属酔母が可能である(表1).しかし，花に生息している他の酵母は多かったと述べている 9) 花を試料とした今回の分離結果エタノールにより生育阻害を受けるため増殖が抑制され， .c e r e v i s i a e以外に 7株の P i c h i α属酵母では， 6柄、の S .c e r e v i s i a eが選択的に増殖すると考えている. その結果 S 2 株の T o r u l a s p o r a属酵母および l株の Candidα属両手母が分離され，K .t h e r m o to l e r an sは分離されなかったこのよー 3 . S .c e r e v i s i a e分離株の生理学的性質 S .c e r e v i s i a e分離株の生理学的性質を清酒用酵母やノ寸ンうに分離された酵母種が異なったのは，ナラの樹皮におけ用酵母と比較するために，糖の発酵性および糖の資化性をる酵母の分布と採取した花における酔母の分布が異なって調べた. なお清酒用酵付:の代表株として K7株を，バン用いたためと推測している e r e v i si a e以外の 10株また， S .c 酵母の代表株として By株を使用した . の分離株はサクラまたはフジから分離されたことから，こ糖の発酵性試験では，表 2に示したように， 6{朱の S ic h ia属などの醇母れらの花には RE培地で増殖可能な P c e r e v l s w e分離株は K7株および By株と同様に夕、ルコーが存在していることが示唆された . ス，スクロ花や果実からのS.c e r e v i si aeの分離には，これまで多くス，カラク卜ース，ラフィノースを発酵し， A メリビオース，トレハロースを発目孝しなかった. No. 122 の時間と手聞が投じられてきた.柏木の報告によると，や株， K7株および By株はマル卜ースを発酵した. 6株の S まぐち・桜酵母の分離では，花の収集から 8段階の集積培 c e r e v i s i a e分離株の糖の発青年J性プロファイルは文献他と合 .c e r e v i s i a eの同定までに約 8ヶ月を要したが，養を経て S 致していた. S .c e m v i s i a eは l株しか得られていないけ.松田らはサク糖の資化性の試験結果を表 3に示した. 6株のs. ランボ果実を試料として 3段階の培養を行い， SSUrDNA c e r e v i s i a e分離株は K7株および By株と同様にグルコーの TGGE法による解析という複雑な方法でス，スクロース，ガラクトース，ラフィノースを資イヒした. S .c e r e v i s i a e を検出している. しかし， S .c e r e v i s i a eが検山された培養 No.1 2 2株， K7株および By株はマルトースを資化し，糖 e r e v i s i a eは 5.4%しか存在していなかっ液中においても S .c .c e r e v i s i a e分離の発酵性試験の結果と一致した. 6株の S た3) D ーグルコシドを資化したが， K7株および株は αーメチル - また，関口らは北海道の続物から微好気培養と顕微 .c e r e v i s i a e 鏡観察により 262株の出芽酵母を分離したが， S By株は資化しなかった. No 52株， NO.66株， NO.71株，目表 2 S .c e r e v i s i a e分離株の糠の発酵性醇母試験株糖 K7 By 5 2 6 6 7 1 9 0 1 0 1 1 2 2 文献値 16) G l u c o s e + + + + + + + + + S u c r o s 巴 + + + 十 + + + + V G a l a c t o s e 十 + + + + + + + V R a f f i n o s巴 + + + + + + + + n Maltose + + + V Tr 巴h a r o s巴 n M e l i b i o s e n +，発酵，ー，発両手せず v， l 記株により異なる; n，記載なし. K7，清酒用協会酵母 K7株; By，バン酵母 By株 5 2， 6 6， 71 . 9 0， 1 0 1， 1 2 2， s .c e r e v i s i a e分離株. m (35) 安田・北本:花からの有用酵母の分離と多様性 437 表 3 S .c e r e v i s i a e分離株の糖の資化性酵母試験株帯主 K7 By 5 2 6 6 7 1 9 0 1 0 1 1 2 2 文献値 16) Glucose + + + 十 + + + + n Sucrose + + + + + + 十 + V G a l a c t o s巴十 + + + + + + + V R a f f i n o s e + + 十 + 十 + + 十 V Maltose + + + V Tr巴h a r o s e 明/ C e l l o b i o s c 明J α . M e t h y l D g l u c o s i d e w V + + + + + M e l i b i o s巴 Mannitol + n n w V L a c t o s c S o r b i t o l n G l y c e r o l n Mel巴z i t o s e + + 十 + 十 Sorbos巴 + n n +，資化 W ，わずかに資化資化せず ;v，f a i株により異なる n，記載なし. K7，清酒用協会酵母 K7株; By，バン用酵母 By株 5 2，6 6，7 ， 1 9 0， 1 0 ， 1 1 2 2，S .c e r e v i s i a e• 分離株. NO.90株， No.1 0 1株および By株はメレジ卜ースを資化 2 2株および K7株はメレジ卜ースを資化しなかっ，し No.1 .C e r eVlS l a e分一離株の糖の資化性フロロファイルた. 6株の S は文献値と合致していた. 以上のように，糖の発酵性と糖の資化性のプロファイル， No.661 朱， NO.71株， NO.90 は，分離株間では NO.52株株， No.1 0 1株が同一ーで， No.122株のみが異なった 6株のS .c e r e v i s i a e分離株の糖の資化性プロファイルは， K7 株および By株とは異なっていた. 酒類やノ f ン類の製造において新規酵母を利用する場合には，既に製造現場で使用している実用酵母に悪影響を及ぼすことのないよう，キラー性のないことを確認しておくことが重要である.そこで 6株の S .c e r e v i s i a e分離株につい図 2S .c e r e v i s i a e分離株のキラー活性 (A)，清酒用協会酵母 K7株に対するキラー活性; (B)，バン用酵母 By株に対するキラ活性. Control，キラ 0 0 7株1， N o .5 2株; 2 ，N o .6 6株 3 ， NO . 7 1株;4 ，NO.90株;5，N o .1 0 1株;6 ，N o .1 2 2株. て， K7株および By株に対するキラー性試験を行ったところ，図 2に示したように 6株のS.c e r e v i s i a e分離株はいずれも K7株および By株に対してキラー性を示さなかった. 制限酵素 Hin f Iおよび制限酵素 R s a Iの切断認識配列は酵母染色体 DNA上 l こは多く存在しているが mtDN A中に 4 . S .c e r e v i s i a e分離株の遺伝的多様性解析は極めて少ないことから，全 DNAをこれらの制限酵素でバルスフィールドゲル電気泳動によるクロモソーム解析消化することにより mtDN Aの多型解析 (mtDN ARFLP) .c e r e v i s i a e を始めとする色々な分子生物学的手法により， S が可能である 14) S .c e r eVlS l a e分離株と対照株の mtDN A の亜種あるいは株レベルの判別が試みられている.本報で RFLP解析結果を図 3に示した . 明瞭な DNAバンドがは比較的簡便で判別力の高い方法である mtDN ARFLP (A) 制限酵素 H inf Iでは約1.7-5 . 0kbpの範囲に，解析および Ty1deltaエレメン卜の PCR解析により，s. 限酵素 R saIでは約l.7-9.0kbpの範囲に観察された.株聞 C e r eVlS l a e分離株の遺伝的多様性を分析した. の DNAパンドバターンを比較したところ， (B) 制白い矢印で示第 9号日本食品科学工会学会誌第 58巻 438 2011年 9月 e 2345678M ( k b p ) M 06 ワ r - nhu Fhd A性 qd n J臼 'EA M (zba EA 噌 )、け 00000O 仏8 6 5 4 1 、， A M ，、 M (36 ) 2 . 0 1 .5 1 . 。 0. 5 0 . 4 0 . 3 02 噌 L 内 qru--1i nUEU 0 . 1 図 4 S .c e r e v i s i a e分離株の deltaエレメントの PCR解析 M，2 . LogDNALadder (NEWENGLANDBioLabs);1 ，K 7株;2 ，By株;3 ，N o .5 2株;4，N o .6 6株;5 ，N o .7 1株;6 ， NO.90株;7 ，N o .1 0 1株;8 ，N o .1 2 2株. ( B ) ( k b p ) M l0 . 0 8 . 0 6 . 0 5. 0 且0 『司・ 1 2 3 4 5 6 I 7 8 M で= ~ 闇鳩山田=ー圃-ーー冊目. 忌 z 三喜三 0 ・岨 i ら. RE培地で生育した 6株の S .c e r e vi s i a eは培養液中でそれぞれ単一株として存泊二していたと考えられる. ーーーー -ーー一一一一一一一一一一 . コ i Ty1d e l t aエレメン卜の PCR解析により，今回分離し .c e r e v i s i a e分離株はた 6株の S K7株および By株とは異なる株として判定されると共に，分離株聞における染色体 DNAの多様性が示された.また Ty1d e l t aエレメントの .c e r e v is i a e株 PCR解析は mtDN ARFLP解析に比べて S I 能が高い分析プ ' J " f l ーであることが示唆された. 聞の判月J 図 3 S .c e r e v i s i ae分離株の mt DNARFLP解析 e r e vi s i a eの分離をさらに継続して今後は花からのS. c (A) ，~IiIJ 限両手京 Hinfl; (8) ，~IiIJ 限百年素 Rsa l による切断ノ守ターン白い矢印は同一バターンを示す. M，2 ・L ogDNALaddcr (NEWENGLAND8ioLabs);1 ，K 7株;2 ，8y株;3 ，No.5 2株;4 ，N o .6 6株;5 ，N o .7 1株 ;6 ， NO.90株;7 ，N o .1 0 1株 ;8，N o .1 2 2株. e r e v i s i a e分離株の酒類やより多くの株を取得した後 S .c ノf ン鎖製造への応用に閲する試験を行う予定である. 要約油会買やノマンなどの発酵食品に新しい特徴を付与するたす NO.66株と NO.90株のノ寸タンが同一であったが，そ K れ以外の NO.52株， NO.71株， No.1 0 1株， No.1 2 2株， 7株および By株のパターンはそれぞれ異なっていた.この結果から， 6株の S .c e r e vi s i a e分離株は K7株および By 株とは異なる株として判定され，一部を除いて分離株聞における mtDN Aの多様性が示された. er e V lswe染色体￨二に存在する deltaエレメン卜は， S .c αc charomycesc e r e v i s i a eの新規分離株め，自然界からの S が必要とされている . 我々は選択増殖培養と rDNA 5 . 8 S-ITS領域の PCR制'析を組み合わせた分離方法により， .c e r e vi s i a eの新規取得愛知県内のサクラなどの花から S を試み. 6株の分離に成功した. 6株の S .c e r e v i s i ae分離株について糖の発酵性と糖の資化性を調べた.糖の発酵性および糖の資化性プロファイルトランスポソン Ty1の末端繰り返し配列 (LTR)である. .c e r e v i s i a e は 5株が同一で. 1株のみが異なった. 6株の S K7株およびこの de l t aエレメントの 5'末端に相向性を持つプライ分離株の糖の資化性プロファイ jレはいずれもマ一対を用いた PCR産物のノ f ターン解析により， S .c e r e v i s i ae分離株 By株とは異なっていた.また. 6株の S c e r e v l s w eの株レベノレでの判別が可能である 15) この手法 7株および By株に対してキラー性を示さなかった. はK .c e r e v i s i a e分離株の解析を行った結果を用いて 6株の S ( 図4 )， 6株の S .c e r e v i s i a e分離株， K 7株および By株す e r e v i s i a e分離株の mtDN ARFLP解析を行っ 6株のS.c た結果 2株聞の一致を除いてそれぞれ異なるプロファイべてにおいて DNAパンドのサイズや数が異なっており，ルを示した. Tyld巴l t aエレメン卜の PCR解析の結果それぞれ固有のバターンが観察された. データは示さない .c e r e v i s i a e分離株はすべて異なるプロファイノレを株の S が， No.52，No.6 6 . No.7 1，No.90および No.1 0 1の 6サ 7株および By株とも異なっていた示し. K ンプルよりシング jレコロニーイ七によって得=られたコロニー .c e r e v i s i a e分離株の遺伝的多様性が示されから. 6株の S の中からそれぞれ 1 2コロニーをランダムに選び. deltaエ f こ. 6 これらの結果レメン卜の PCR解析を行った結果，同一サンプル由来の 1 2コロニーでは同一のバターンが観察されたこの結架か本研究の一部は(財)エリザベス・アーノルド富士財団 (37 ) 安田・北本花からの有用酵母の分離と多様性の学術研究助成により遂行されたものであり，ここに感謝の意を表します.また実績に ζ助力頂きました鈴木美南氏に感謝致します. 文献 1 ) 柏木享，桜の花から分離した醇母による清酒の商品化， 7， 2 6( 2 0 0 2 ) 白本:自喜造協会誌， 9 2 ) 大橋正孝，都築正男，消7l<浩美，松淳一幸，藤野千代，鈴木孝仁，岩口伸一，ナラノヤエザクラの花からの有用な酔母の分離及びそれを使った清酒の開発，奈良県工業技術センター研究報告， 3 5， 3 5 3 8( 2 0 0 9 ) . 3 ) 松田義弘，工藤普平，小関敏彦，上木厚子， -'木勝司，分子 a c 系統解析を用いたサクランボ果笑からの香気生産 S l i i株の分自l t.白木醸造協会誌， 1 0 0， c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei 1 9 9-2 0 8( 2 0 0 5 ) 4 ) 松田義弘，上木厚子，仁木勝司，各種果笑から分離された香寺の同定と香気生産特性，日本醸造協会誌，気生産性野':t:両手 l 1 0 4， 5 7 7 4( 2 0 0 9 ) . 5 ) 関1 1幸恵，田中みち子，高橋淳，浅野行蔵，北海道の植物からのお ccharomyces 属博Ii}.の単語lf と製バン適↑~L 1 : 1 本殴 0 3， 1 2 5-1 3 4( 2 0 0 8 ) 造協会誌， 1 6 ) Oda， Y .，Mikumo，0 .， Tajima， K .andYamauchi， H .，Chari z a t i o no f an a l t e r n a t i v c baking s t r a i no fS aca c t巴r 日ei s o l a ted from ferment巴d chcrry c h a r o m y c e sc e r e v i s i f r u i t sbyt h ea n a l y s i so fSUC2g e n c .FoodSc i .T e c h n o l R e s . .1 6，4 5 5 0( 2 0 1 0 ) 7 ) 高峯和則，大山修一，吉崎F. B 美子，玉商尚徳，鮫島吉J 黄，土壌からの焼酎隣周の分離と分離酵母の実用化， ' 1 1 :本綴造協 0 5， 5 4 65 5 5( 2 0 1 0 ) 会誌， 1 8 ) Sniegowski，P. D. ，Dombrowski，P . G .andFingerman，E .， Saccharomycesc e r e v i s i a eandSaccharomycesparadoxus c o e x i s ti nan a t u r a l woodl and s i t ei n North America and d i s p l a yd i f f e l巴n tl cvel so f reproductivc i s o l a t i o n fromEurop巴anc o n s p c c i f i c s .FEMSY e a s tR e s .，1，2 9 93 0 6 ( 2 0 0 2 ) 439 9 ) Sampaio，J . P .andGoncalves ，P .，Naturalpopulat i o nso f Saccharomycesk u d r i a v z e v i ii n Portugala r ea s s o c i a t e d withoakbarkanda r esympatricwithS .c e r e v i s i aeand a r a d o x u s .A p p l . Envi γo n .M i c r o b i o ， . l 7 4，2 1 4 4-2 1 5 2 S .p ( 2 0 0 8 ) 1 0 ) Esteve-Zarzoso，B .，B e l l o c h，c . ， Uruburu，F .andQuerol， A . ，I d e n t i f i c a t i o no fyeast sbyRFLPa n a l y s i so ft h e5 . 8 S rRNAgeneandt h et wor i bosomali n t c r n a lt r a n s c ri bed s p a c e r s .J n t .J .S y s l .B a c l e r i o l .，4 9，3 2 93 3 7( 19 9 9 ) .P . and Robnett，C . J .，I d巴n t i f i c a t i o n and 1 1 ) Kurtzman，c phyl o g e ny o f ascomycetous ye a s t sf r om a n a lys iso f nuclearl a r g巴 subunit( 26S)r i b o s o r r i a lDNAp a r t i a ls e q u e n c e s .A n l o n i eVanLeeuwenhoek，7 3，3 3 1 3 7 1( 1 9 9 8 ) )，I 微生物の分類と同定 J ， 1 2 ) 後藤昭二，酵母の分類と同定 0 初版，長谷川武治編， CJ:!i京大学出版会，東点)，pp 6 7-1 0 1 (975) Jの育種，日本醸造協会誌， 74， 1 3 ) 大内弘造，キラー清酒隣 I 6 4 2 6 4 7( 19 7 9 ) . 1 4 ) Qu巴1'0 1，A .，B a r r i o，E .，Huerta，T .andH.am凸n，0 .，Molecul a r monitori ng o f wine fermentations conducted by a c t i v edry y e a s ts tr a i n s .App . lE nvi l'On .M i c r o b i o. l，5 8， 2 9 4 82 9 5 3( 1 9 9 2 ) 1 5 ) Hayford，A . 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