DDBJing講習会 2015年7月29日 那覇 プライマーの作成・活用の実際 森 宙史 Hiroshi Mori 東京工業大学 大学院生命理工学研究科 生命情報専攻 助教 [email protected] 1 このスライドの置き場所 http://mdb.bio.titech.ac.jp 2 自己紹介 東工大・生命理工・生命情報、黒川・中島・山田研で研究しています ・ 微生物のゲノム解析における情報解析 細菌・真核藻類 等 (Hori et al., 2014), (Kato et al., 2015) ・ メタ16S・メタゲノム解析における情報解析 ヒト腸内・土壌 等 (Kurokawa et al., 2007), (Mori et al, 2014) 細菌のUniversal プライマーの設計と評価 ・ 微生物ゲノム・メタ16S・メタゲノム解析に関するツール開発 MiGAP・VITCOMIC・CLAST 等 (Sugawara et al., 2009), (Mori et al., 2010), (Yano et al., 2014) ・ 微生物統合データベース MicrobeDB.jpの開発 3 2時間の講義+実習の概要 • • • • PCR法を利用した試験の重要性 PCR法の概要 特異的プライマーとUniversal プライマーの違い 生物の系統ごとのUniversal プライマーの標的に適 した遺伝子 • 新規プライマー設計で気をつけるべきこと • Primer3Plusを用いたプライマー設計実習 • BLASTNを用いた増幅される生物の範囲の推定 4 全ての生物/virusを見た目で 種名同定できれば楽だが… • 昆虫等であれば、特に幼虫や卵の見た目での種 名同定の困難さ • 微生物やvirusであれば、小さい故の見た目での検 出・同定の困難さ、培養にかかる時間や困難さ 見た目では難しいならどうすれば？ 5 全生物/virusはDNA/RNAに 遺伝情報をコードしている • ゲノムDNA/RNAを対象にすれば、同じような分子 生物学的手法で全生物/virusを評価可能 • しかし、1個体の生物/virusが持つゲノムDNA/RNA は僅か ゲノムDNA/RNAを増やす必要がある 6 PCR法の概要 例 95℃ 30秒 RNA virusの場合は RT–PCR 55℃ 30秒 72℃ 15秒 Wikipediaの PCRのページから取得 7 PCRで増幅後は… • 増幅産物をシーケンスして既知の配列と比較して、系 統を推定 • EtBrなどで増幅産物を処理して電気泳動してバンドの 有無を確認 • 増幅産物を制限酵素処理後に電気泳動してバンドの パターンを見る プライマーの種類で どの生物のどの遺伝子のどの領域を増幅するのか が決まり、その後の解析方法も変わる 8 PCRを利用した遺伝子診断法 • 結果が出るのが速い（数時間ほど） • 見た目では判別困難な生物や、培養困難な菌/virusも 解析可能 • DNA/RNA抽出効率やサイクル数に依存するが、基本 的には検出感度が高い • 新規な生物でも、増幅後にシーケンスすれば塩基配 列が得られるので、既知の生物との系統解析が可能 • それほど職人技はいらない • ターゲット遺伝子とプライマーを工夫することで、ごく近 縁な系統間の識別も可能 9 PCRに使うプライマーは 大きく分けて2種類 • 系統特異的なプライマー • 系統Universalなプライマー 両者は何が違うのか？ 10 系統(機能)特異的プライマー 例えば、 • 腸管出血性大腸菌とそうではない大腸菌を判別した い • Fusarium oxysporumのレースを判別したい などの病原性の有無の判定を迅速に行いたい場合に使 われたりする。 遺伝子レベルで病原性のメカニズムがわかっている生 物の場合、 • ある遺伝子を持っているか否か？ • ある遺伝子に一塩基置換があるか無いか？ が、病原性の有無に重要であるような場合には、非常に 有効なプライマーが設計可能な場合が多い。 11 系統特異的プライマーの特徴 • 系統判定には増幅産物のシーケンスをしなくても 大丈夫（PCR後の電気泳動でバンド出るか否か） • どの遺伝子を使うかはバラエティに富む • PCR条件を厳密に検討する必要がある（非特異的 増幅の回避が重要） • degenerate primerが少ない degenerate primerとは？ 12 Degenerate primer 例: 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ • 曖昧（縮重）塩基を使ったプライマー 曖昧塩基 塩基1 塩基2 塩基3 R A G Y C T S G C W A T K G T M A C B C G T D A G T H A C T V A C G N A C G 塩基4 T 13 Universalプライマー • 幅広い系統群を増幅できるプライマー 用途 • 系統の判別 • 群集組成を見る 特徴 • 増幅産物の系統判別には基本的にシーケンシングが 必要 • degenerate primerが多い • ターゲットになりうる遺伝子は少数 具体的にはどのような遺伝子が使われている？ 14 虫（カブリダニ、ミバエなど） • cytochrome c oxidase subunit I（CO1 or COX1 or COI） COはミトコンドリアにおける電子伝達系の酵素であり、タンパ ク質複合体。COX1はその中心的な酵素で、ミトコンドリアゲノ ムにコードされている。 • 28S rRNA遺伝子 or 28S rDNA 28S rRNAはmRNAからアミノ酸を翻訳してタンパク質合成の 場となるリボソームの核となるribosomal RNAの一つ。その遺 伝子。細胞の核にコードされている。 15 線虫 • COX1 • 18S rRNA遺伝子 or 18S rDNA 18S rRNAはmRNAからアミノ酸を翻訳してタンパク質合成の 場となるリボソームの核となるribosomal RNAの一つ。その遺 伝子。細胞の核にコードされている。 16 菌類(糸状菌・酵母, 具体的には Fusarium, Pythiumなど） • • • • • 28S rRNA遺伝子 18S rRNA遺伝子 COX1 COX2 rDNA–ITS1 (internal transcribed spacer), rDNA–ITS2 18S rDNA – ITS1 – 5.8S rDNA – ITS2 – 28S rDNA 17 細菌(Pseudomonas, Burkholderiaなど） • 16S rRNA遺伝子 • rDNA–ITS 真核生物: 18S rDNA – ITS1 – 5.8S rDNA – ITS2 – 28S rDNA 原核生物: 16S rDNA – ITS – 23S rDNA – 5S rDNA 18 Virus (植物関連はほぼ全てRNA virus) • • • • Tospovirus Nタンパク質 Comoviridae RNA-dependent RNA polymerase Tombusviridae RNA-dependent RNA polymerase Flexiviridae RNA-dependent RNA polymerase、外 被タンパク質（Coat protein) • タバコモザイクウイルスなどの棒状ウイルス 外被 タンパク質 19 Universalプライマー ターゲット遺伝子まとめ • 真核生物はCOX1がBarcode of Life http://www.boldsystems.org/ などのデータベースも充実してい るのでよく使われている。 • 菌類に関してはrDNA-ITS2がUNITE https://unite.ut.ee/index.php などのデータベースが充実してお り、主流。 • 細菌は16S rRNA遺伝子が主流だが、種よりも細かい分類を したい場合はITS。 • VirusはRNA-dependent RNA polymeraseやCoat proteinが使 われることが多い。 ターゲットの遺伝子は大体わかった 20 新規プライマー設計で 気をつけるべきこと • プライマーの長さ • プライマーのGC含量 • Melting Temperature (Tm値） 二本鎖DNAの50%が解離して一本鎖DNAになる温度のこと これがプライマー間ですごく異なると、PCRの温度設定で困る • プライマー配列の相補性 • 非特異増幅の有無 タカラバイオの、リアルタイム PCR 実践編 -プライマー設計ガイドライン – 21 http://www.takara-bio.co.jp/prt/pdf/prt3-1.pdf プライマー間の相補性の問題 (Untergasser et al. 2012) 22 実際どうやって設計する？ Primer3Plusを使って設計する http://primer3plus.com/ 簡単な使い方は 統合TVの PCRプライマー設計ツール Primer3の使い方 2011 http://togotv.dbcls.jp/20110111.html 23
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