ミトコンドリア DNA (mtDNA) の塩基配列決定１．検体サンプルの調整心筋、大動脈から分離した DNA を 20ng/ul に調整２．mtDNA の Long PCR mtDNA 全体を longPCR を用いて 3 分割で増幅し、核 DNA 上の mtDNA 類似配列を除外する（Akanuma et al. 2000）。プライマーセット A fragment, m.5223 – m.12024 (6,789 bp) Forward: 5223F: 5’- TTCCATCCACCCTCCTCTCCCTAG-3’ Reverse: 11988R: 5’- GAGCCCCATTGTGTTGTGGTAAATA -3’ B fragment, m.10710 – m.16427 (5,718 bp) Forward: 10710F: 57- GTGGGCCTAGCCCTACTAGTCTCAA-3’ Reverse: 16403R: 5’- GGGATATTGATTTCACGGAGGATGG-3’ C fragment, m.15775 – m.5739 (6,534 bp) Forward: 15775F: 5’- GAATCGGAGGACAACCAGTA-3’ Reverse: 5720R: 5’- GCGGGAGAAGTAGATTGAAG-3’ PCR 増幅 TaKaRa LA-taq: タカラバイオ, 5U/ul <反応ミックス> 10 x LA buffer II 5.0 2.5mM dNTPmix 8.0 4uM Forward primer 2.5 4uM Reverse primer 2.5 LA-taq. 0.3 DNA template 1.0 DDW 30.7 Total 50 ul サイクリング・プロトコール 94℃ 5 min 94℃ 40 sec 62℃ 30 sec 72℃ 5 min 72℃ 10 min 35 cycles ３．Long PCR 産物の確認ゲル：1.0%アガロースゲル、１ｘTAE buffer PCR 産物: 0.5 ul 泳動条件：100V, 1 時間４．Long PCR 産物の精製 Microspin S-400 HR (GE Healthcare Life Sciences)で精製５．Cycle seqiencing 反応 BigDye Terminators v1.1 Cycle Sequencing kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) で、69 種類のシークエンスプライマー（添付）のシークエンスプライマーを用いて反応させ、Sephadex G-50 DNA grade F (GE Healthcare Life Sciences) を用いて精製する。６. オートシークエンス解析と評価 ABI 3730 XL automated sequencer (Life Technologies) を用いてしーくエンスデータを得る。改訂されたヒト mtDNA 標準配列 rCRS: GenBank sequence NC_012920 gi:251831106 と比較する。ヒト mtDNA の最大のデータベースである MITOMAP (http://www.mitomap.org/MITOMAP)及び日本人 mtDNA データベースである mtSNP (http://mtsnp.tmig.or.jp/mtsnp/research_e.html)、 NCNP インハウス DB を用いて病因性を推定する。【参考文献】 Akanuma J., Muraki K., Komaki H., Nonaka I., Goto Y. Two pathogenic point mutations exist in the authentic mitochondrial genome, not in the nuclear pseudogene. Journal of Human Genetics. 45, 337-341 (2000).