Hirosaki University Repository for Academic Resources Title 皮質 : 海馬伝達機構の高速画像解析法およびマルチプローブダイアリーシス法を用いた検討 Author(s) 岡田, 元宏; 朱, 剛; 吉田, 淑子; 金井, 和明; 兼子 , 直 Citation Issue Date URL Rights Text version 精神薬療研究年報. 35, 2003, p.74-87 2003-03 http://hdl.handle.net/10129/4210 本文データは財団法人先進医薬研究振興財団の許諾に基づき複製したものである。 publisher http://repository.ul.hirosaki-u.ac.jp/dspace/ 第3 5集 2003年 3月精神薬療研究年報 74 皮質一海馬伝達機構の高速画像解析法およびマルチプローブダイアリーシス法を用いた検討 ♯ * 剛明日H ま｣井朱金 * + + * 宏子直元淑田田子岡吉兼抄韓 :Ent or hi na1 c or t e x( EC) から海馬への神経伝達機構 ( ECH) を高速蛍光 CCD カメラを用いた興奮伝播二次元解析法とグルタミン酸･GABA の開口分泌機構をマルチプローブダイアリーシスを用いて検討した.腹側海馬 CAl領域の錐体細胞層は,EC 第 Ⅰ Ⅰ ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ ･Ⅰ Ⅴ 層からのグルタミン酸性興奮性入力を受けていたが ,EC 第Ⅰ Ⅰ ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ層からの入力が主要入力であり,EC 第 Ⅰ Ⅴ 層からの入力は EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ層からの興奮性入力を補助的に増強した. この EC から海馬への人力は,一部 GABA による抑制性制御を受け,EC 第 Ⅰ Ⅰ ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ層よりも EC 第 Ⅰ Ⅴ 層からの入力がより強力な抑制性制御を受けていた.ECH 各領域のグルタミン酸遊離は PKA による制御を受け,逆に GABA 遊離は PKC優位の自発性遊離機構と PKA優位の脱分檀性遊離機構による二系統の制御機構を有していた.以上より EC から腹側海馬 CAl 領域への投射経路は, グルタミン酸作動性伝達が主要機構であったが, これは直接, 錐体細胞へ投射する経路と,GABA 性介在神経へ投射し間接的に抑制性制御を発動する経路が存在することが示唆された. 精神薬療研究年報第 35集 :7 4- 87,2003 Keywords:e nt o r h na i lc o r t e x, hi ppc m pus a , o pt i c li a ma g l ng, ic m r o d i lys a i s , e pi l e ps y 緒 EC は海馬への主要入力領域であり,EC 第 Ⅰ Ⅰおよ言 Ⅰ Ⅰ層から DG への入力 ( per f br antpat hway) びⅠ 中枢神経系における " m山t i s y na pt i c "伝達障害はが古典的入力経路として 27,, その伝達系機能が数アルツハイマー病 10 J ,パーキンソン病 3 , ,てんかん 6 ･多く研究されてきた.海馬内の神経回路は,DG 内等の神経疾患 ,そして感情障害 19等の精神疾患のの gr anul ec el l sが mos s yf iberaxonsを CA3領域病態に関与すると考えられている.特に,てんかの py rami dalc el l sに投射し,CA3領域の pyrami - ん 6' およびアルツハイマー病 10 ･の標的部位として, dalc el l sに Sc haf dalc el l sは CAl領域の pyrami ent or hi naトc or t ex ( EC) 仙i ppoc ampal神経回路 erc f ol l at e r al sを投射している.CAl領域の pyra- ( ECH)の神経伝達障害が重要な役割を演じている mi dalc el l sは s ubi c ul um に投射し最終的には,深と考えられている 6 ' 1 0 J 部 ECへ再投射している 1'8' 27･ . これら海馬内の DG 海馬は主に de nt at egyr uS ( DG), Co nuA r m o ni s から subi cul um への投射系は古典的な ` ` mul t i r eg ioi nf er i or ( CA3),s uper i or ( CAl) そして s ynapt i c"モデルとして, ■ t r i s ynapt i cpat hway s ubi c ul um の 4領域によって構成されている 1 , 2 7 ･と称されている 2 . 更に,その他の投射系として, 8562弘前市在府町 5,**シバタバイオテック神経科学研 *弘前大学･医学部･神経精神医学講座 ;〒036究所 ;〒03 6808 4 弘前市高田 *De par t me nto rNe ur o ps yc hi at r y,Sc ho o lo rMe di c i ne, Uni ve r s i t yo rHi r o s a ki ,Hi r o s a ki0368562, Japa n. * * I ns t i t ut eo rNe ur o s c i e nc ea ndMo l e c ul arBi o l o gy, Shi ba t aBI OTEC, Hi r o s a ki036808 4, Japa n. 精神薬療研究年報第3 5集 2 003年 3月 75 ECから CAl･CA3の pyr ami dalc e l l sへの入力用い染色した.染色終了後 ,95% も報告されているが多くは組織学的な検討で,伝でバブリングした人工脳脊髄液 ( ACSF),NaCl 0 2/ 5% C0 2 達系機能の機能的解析は行われていない 22'27' 1 25;KC12. 5;NaH2PO 4 1. 25;CaC1 22 ;MgC1 2 1; ECH の情報伝達では,主に興奮性はグルタミン酸系,抑制性は GABA系伝達系によって制御されて NaHCO 3 25,gl uc o s e1 0( mM),pH 7. 35を還流し,電位変化を高速 CCD カメラ搭載蛍光顕微鏡でいると考えられているが 4 7､ 8 2 5 2 7 ㌧ ECから CAlへ測定した 23･ 24 , .EC ･海馬を含有するスライスはの直接投射に関わる伝達系機能の詳細は明らかに MED プローブ上の 64電極上に位置するように接されていない. 着し,各電極を 1 00〟A ( 0. 1ms e c )で刺激した. mul t is yna pt i c "伝達の解析において, シ一方, " Mi crodi al ys i spreparat i on ナップス後膜の神経伝達物質受容体の反応と, シ 1. 5%ハロセン吸入麻酔下で体重 250- 300gのナップス前終末からの神経伝達物質遊離 ( 開口分 s t ar系ラットに mi c r o di al ys i sを二本挿入雄性 Wi 泌)の機構解析が各方面で検討されているした.透析膜長 2m 4' 5, 13' 15' 20, の mi c r o d i a l ys i spr o be ( 0. 22 特に,pt ypevol t ages ens i t i veCa2- c hannel mm di ame t e r;2mm e xpo s e dme mbr ane;Ei c o m, ( vscc)はシナップス前終末に高密度に分布し開 Kyo t o,Japan) を EC ( A ニー7. 8mm,L - 5. 8 口分泌機構の主要制御因子と考えられ,逆に N- mm,Ⅴ t ypeVSCC は二次的な修飾的機能を有しているに 2 6 . しかし,我々は i n 過ぎないと考えられている 21' 腹側海馬 ( A ニー5. 8mm,L-5. 8mm, Ⅴニー6. 8 mm r el at i vet obr egma) に挿入し,背側海馬 u i u om ic r o di al ys i sを用い,モノアミン開口分泌が ( A ニー5. 8mm,L-5. 2mm, Ⅴニー3. 4mm r e l a- ニー6 , 2mm r e l at i vet obr e gma)あるいは h Nt ypeVSCC/ c al c i umphos pho l i pi dde pe nde nt t i vet obr e gma) には透析膜長 1mm の pr o beを ppr o t e nk i nas i e( PKC) / s y nt a x n"機能複合体と " i obe挿入 24時間後に,流速 1 〟l/ 挿入した. Pr t ypeVSCC/ c yc l i cAMpde pe nde ntpr o t e i nki nas e mi nで修正リンゲル液 ( MRS) [ 1 45Na ,2. 7K一, ( PKA)/ s ynapt o br e vi n'機能複合体によって制御 1. 2Ca2+,1. 0Mg2+,1 54. 4Cl ( i nmM)2mM リ ) 11' 13-1 5 ･ 1 6 されていることを明らかにしてきた 9 本報告では,我々が開発した高速 CCD カメラを O pt i c alMED64s ys t e m" 1 2 1 7 2 8 ' 搭載した蛍光顕微鏡 " と mul t i pr o bemi c r o di al ys i sを用いて,ECH におけるグルタミン酸系伝達系機能と GABA系伝達系機能の相互作用を検討した. 方法 . 1mM Tr i s緩衝液で pH 7. 40に調ン酸緩衝液と 1 ' .20分間隔で MRSを回収整]潅流を開始した 1 3 ' 1 5 luor ec enc eHPLC を用いて MRS内の gl ut aしf ma t e ･GABA濃度を測定した 28･. MRS潅流開始 6時間後,潅流 MRS内の gl ut amat e ･GABA 濃度測定を開始し,60分間の CV 値 5%以下を安定化と定義した 15 , .安定化確認後, c o nt r o lとして gl ut amat e ･GABA 基礎遊離測定二次元興奮性伝播解析 c uを 60分間行った後に,GABA A受容体阻害薬 bi s t ar系 r a t s( Cl e a, To kyo , 週齢 2- 4週の雄性 Wi c ul l i ne ( Bi c:和光,Os a ka) ,AMPA受容体阻害薬 Japan)の EC と腹側海馬を含んだ領域を摘出し, DNQX ( ナカライテスク,Os aka),PKA 阻害薬 300〟m のスライスを調整した 8 .調整したスライ H89 ( Cal bi o c he m,SamDi e go,USA) ,PKC作動スは,po l ye t yl e ni mi ne処理を施した MED プロー薬p ho r bo l1 2my r i s t at e1 3ac e t at e( PMA :ナカブ ( MEDP51 5A,A l phaMEDSc i ,To kyo,Japan) に設置し,1 0% ウマ血清 ,1 0%牛胎児血清と 1% ライテスク),PKC 阻害薬 c he l e r yt hr i ne ( CHR : N2サプリメントを含有した DMEM/ F12培地上 o r s ko l i n Cal bi oc he m),ade nyl ylc yc l as e作動薬 f ( Fo r:ナカライテスク)を MRSに溶解還流した 15,. 2 ' 1 72 8･ .培養後,電位依存性蛍光で 2 日間培養した 1 各種薬剤還流投与後,測定値の安定化確認後 ,同指示薬 d i 4ANEPPS ( 1 00〟M)( Mo l e c la u r Pr o be s , 様の薬剤を含有した 5 0mM K･含有 MRS( HX M RS) Euge ne,Or e. ,USA),2. 7% エタノールと 0. 1 3% 潅流 ( K刺激) を 20分間施行した 9-11･15)28, c r e mo pho rEL 含有した上記 DMEMn1 2培地を (-) (-) (-) I I I +Ⅰ Ⅴ (-) -CAl ( 〟6) EC=〉 DG=〉 CA3=〉 CAI EC=〉 DG=〉 CA3=〉 CAI Ⅰ Ⅰ +Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ +Ⅰ Ⅰ Ⅰ +Ⅰ V = 〉 CAl -CAl ( 2 / 6) EC=〉 DG=〉 CA3=〉 CA1 Bi c( lF L M)+Fo r -CAl -CAl EC=〉 DG-CA3-CAl ( 3 / 6) EC= 〉 DG=〉 CA3 =〉 CAl 3/ 6) -CAl ( EC=〉 DG Bi c( lF L M) +CHR -CAl( 2 / 6) EC=〉 DG-CA3-CAl ( 3/ 6) 5 / 6) EC-DG ( Bi c( lF L M)+H89 -CAl ( 4 / 6) (-)EC=〉 DG=〉 CA3 =〉 CAl EC-DG ( 4 / 6) (-) EC=〉 DG EC-DG ( 4 / 6) (-) EC=〉 DG EC-DG ( 5 / 6)EC=〉 DG (-) (-) 令 Bi c( lF L M)+PMA EC=〉 DG=〉 CA3=〉 CAI -CAl ( 2/ 6) EC= ⇒DG 1 / 6) -CAl ( EC=〉 DG (-) EC= 〉 DG-CA3-CAl ( 3/ 6) (-) (-) EC-DG ( 〟6) (-) EC=〉 DG 2003 St i mul at i o ns i t e EC=〉 DG EC=〉 DG EC=〉 DG EC=〉 DG=〉 CA3=〉 CAI (-) Ⅰ Ⅰ +Ⅰ Ⅴ -CAl ( 2/ 6) H89Fo r EC-DG ( 〟6) (-) EC=〉 DG PMA 部 35淋 Ⅰ Ⅰ +Ⅰ Ⅰ Ⅰ + Ⅰ V CHR EC=〉 DG EC=〉 DG-CA3-CAl ( 3/ 6) EC= 〉 DG-CA3-CAl ( 3/ 6) EC-DG ( 3/ 6)EC= 〉 DG (-) EC=〉 DG EC=〉 DG (-) Bi c( 1 0〟M) EC=〉 DG EC=〉 DG ( -) Fれ u Eull m u 一一一 3 n 川 l川 U3 Ⅰ Ⅰ +Ⅰ Ⅰ I Ⅰ Ⅰ I I I I V St i mul at i o ns i t e Co nt r o l Bi c( 1〟M) Tabl eI Ef f e c t so fGABAAr e C e Pt O ra ndpr o t e i nki nas e so npr o pa gat i o no fne ur o na le xc i t a bi l i t y 罫書瀞薄雪 d ' t 3 令甚 3j ] 76 精神薬療研究年報第3 5集 2003年 3月 77 0 1 ･ごド ( l r T MA Cot l L r Ol 愚用 2 3 4 5 .L. 言' F ki 寸志 ;置 6 8 9 1 0 日( ms e c) 空室巳藍･こI ; . L: kT = : . 書覧 7 l L y' ; 空題｣鮎亜ヨ Fi g.1 Ef f e c t so fGABAAr e C e pt O rl nhi b l t O randpr o t e l nki nas eac t i vat o r so npr opagat i o no fneur o nale xc i t a bl l l t yi nEC打c i r c ui t A phas e c ont r as tphot oml C r O gr apho rar athl ppOC ampals l i c ewaspo s l t i o ne donMED64pr o be ( MEDP51 5A) .Thes t i mu一 at i o ns i t ewass e l ec t e datt hel a ye r sI I ,Ⅰ Ⅰ Ia ndI Vi nEC.Fi gur el As ho ws t hec hangel nt henuo r e s c e nc es i g na las s o c i at e dw it hpr o pa gat i o no fneur o nale xc i t a bi l i t i e si nECH f o r mat 1 0naf t e re l e c t r o e vo ke ds t i mul at i o no fl aye r sI I ,I I+I l lo rI I+I l l+ I Vi nEC Fi g ur el Bl ndl C at et hec o nc e nt r at i onde pe nde nte f f e c t so fBI C( 1and1 0〟M)onpr o pagat i onofneur o na le xc l t abi l i t yaf t e re l e c t r o e vo ke ds t i mul at i o no fl a ye r sI I+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+I Vi nEC.Fl g ur el Ci ndi c at e st hee f f e c t so fPMAa ndFo ro T 】pr o pa gat i o no f ' neur o na le xc i t abl l l t yaf t e re l e c t r o e vo ke ds t i mul at i ono fl a ye r I Ii nEC,Theps e udo C o 一 o ur si ndi c a t et he r ewasmo r et han0. 4鶴 e l e vat i o ni nval ueo rampl l t udeo f 什uo r e s c enc es l gna l , 結果 GABA A受容体阻害薬 Bi c( 10J J M)還流投与時, EC 第 Ⅰ Ⅰ .I I I層単独刺激による per f or antpat h- ECH 興奮性伝播に対する AMPA ･GABA A受 wayへの輿懲伝播が生じたが ,EC 第 Ⅰ Ⅴ層の単独容体の効果刺激による他領域への興奮伝播は生じなかった . EC 刺激の ECH 各領域への興奮伝播に対する, EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ ⅠⅠ層同時刺激による興奮伝播は per - GABA ∧受容体阻害薬 ,pKA作動薬 ,PKA阻害薬. f or antpat hwayに留まらず,一部のスライス ( 5/ 6) PKC 作動薬 ,pKC 阻害薬の効果を Tabl e lにまでは.mos s yf i ber,Sc haf f erc ol l at er alpat hway とめた. への伝播拡大に加え,EC から CAl領域の直接的 EC 第 II IⅠ Ⅰ Ⅰ ･Ⅰ Ⅴ 層の単独刺激では他領域へ 2/ 6) で生じた ( Fi g. 興奮伝播も一･部のスライス ( の興奮伝播は確認できなかった . 一方 ,Ec 窮 1B).EC 第 Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ層同時刺激では,興奮伝播は Ⅰ Ⅰ+ ⅠⅠ Ⅰ層および Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激で pe r f o r antpat hwayに留まったが,一部のスライス per f or antpat hway)への興懲は ,EC から DG ( ( 1/ 6) で EC から CAl領域の直接的興奮伝播も生 Fi g.1A).EC 第 I I+ I V 層およ伝播が生じたが ( じた. EC 第 Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ 層同時刺激でも興奮伝播はびⅠ Ⅰ Ⅰ+ I V 層の同時刺激では ,EC から他領域へ per f br antpat hwayに留まり.EC から CAl領域の興奮伝播は検出できなかった. の直接的興奮伝播も一部のスライス ( 2/ 6) で模出第3 5集精神薬療研究年報 2003年 3月 78 0 】･二J r i } . _ 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 Al ■■■■一 . L. E し一一 .し , J ー :し : し . -.ヽ t モミ . I7 - i ' t. 占､こ ∴ . ′T lr-1 F, ∼ †l -こ∴ 仁･ I . 一一｢一 1 1 1 2( n l S e C ) 一一､ I 一一 Fi g.2 I nt er ac t i onsbe t weenpr ot el nki nas eandGABAAr e C e pt O rO npr o pagat i o no fne ur o nal e xc i t abi l i t y i nECHc i r c ui t Co ns e c ut l v ei mage sf r o m Fi gur e s2Aand2Bs ho wt hec hangei nt hef luo r e s c e nc es i g nalas s o c i at e d it w hpr opa gat i ono fne ur o na1 e xc 】 t abi l i t j e si nECH c i r c ui t ,Fi g ur e2 Ai ndi c at e st hei nt e r ac t i o nbe t we e n1J JM BI CandPMA ( 0. 1〟M)o rPKC ln ll i bi t o r ,CHR ( 5/ J M)O npr o pagat i o no fne ur o nal e xc i t ab l l l t y,af t e rs i ng lee l e c t r o e vo kedc o s t i mul at i o nofl a ye r sI I+I l li nEC,Fl g ur e2Bi ndi c at e s t hei nt e r ac t i o nbe t wee n1〟M BI Ca ndPKAi nhi bi t o r s( 0. 5〟M H89)o rFo r( 5F L M)o npr opagat j o no fne ur o nal e xc i t abi l i t y,a f t e rs i nl gee l e c t r o e vo ke ds t i mul at i o no fl a ye r sI I+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Vl nEC. Theps eudo c o l our si nd一 C at et he r ewasmo r et han0. 4% e l e vat i oni nval ueo fampl i t udeo fnuo r e s na l . c e nc es l g された. EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ ⅠⅠ+ Ⅰ Ⅴ 層同時刺激では, wayへ興奮伝播が拡大し, 一部のスライス ( 4/ 6) per f orantpat hwayから moss yf う ber,Sc haf f er で EC から CAl領域の直接的興奮伝播が生じた. c o l l at er alpat hwayへの興奮伝播の拡大と,ECか AMPA 受容体阻害薬 DNQX 還流投与では,全ら CAl領域の直接的興奮伝播が全てのスライスでての刺激で他領域への興奮性伝播は確認できなか Fi g.l B) . 生じた ( った ( dat ano ts ho wn). Bi cl〟M 還流投与でも,EC 第 Ⅰ Ⅰ ,Ⅰ Ⅰ Ⅰ層単独刺激による per f brantpat hwayへの興奮性伝播が ei n ki nas eの効果 ECH 興奮性伝播に対する prot PKC 作動薬 PMA 還流投与では ,EC 第 Ⅰ Ⅰ層 , Ⅴ層の単独刺激による他領域へ生じたが ,EC 第 Ⅰ あるいは第 Ⅰ Ⅰ Ⅰ層の単独投与で pe r f br antpat hway Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ層同時の興奮伝播は生じなかった.EC 第 Ⅰ の興奮伝播が一部のスライス ( 4/ 6) で生じたが r f br antpat hwayへ刺激では全てのスライスで pe ( Fi g.lC),EC 第 I V 層単独刺激では per f or ant 3/ 6) で mos s y 興奮伝播が生じ. 一部のスライス ( pat hwayへの興奮伝播は確認できなかった. EC f i ber,Sc haf f erc ol l at er alpat hwayへ興奮が拡大第Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ層および第 Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ層の同時刺激したが ,EC から CAl領域への興奮伝播は生じな r f br antpat hwayへの興奮性伝播は全てのスで,pe かった ( Fi g.lB) .EC 第 I I+ I V および I I I+ ライスで確認できたが ,EC から CAlへの興奮伝 V層同時刺激で,全てのスライスで p er f or n tpat a hI Fi g.lC). また ,EC 第 Ⅰ Ⅰ+ 播は生じなかった ( s yf ibe r,Sc ha f wayへの興奮伝播が生じたが ,mos Ⅰ Ⅰ十Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激では,一部の I V層および第 Ⅰ f erc ol l at eralpat hwayへの興奮伝播および ,EC r f br antpat hwayへの興奮性スライス ( 4/ 6)で pe から CAl領域への興奄伝播は生じなかった. EC 伝播が検出できたが ,EC から CAlへの興奮伝播第Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅴ 層同時刺激では pe r f br antpat h- は生じず ,EC 第 Ⅰ Ⅴ 層の刺激が EC 第 ⅠⅠ或いは s yr l ber,Sc haf f e rc ol l at er alpat hwayから,mos Ⅰ Ⅰ Ⅰ層への刺激に加わっても,興奮伝播へは影響が精神薬療研究年報第3 5集 2003年 3月 79 Tabl e2 Efe c t so fAMPA,GABAAr e C e Pt O r Sandpr o t e i nki nas eso nr e l eas es GABAr e l eas esi n ECandCAlr e g i o ns Bas a1 K+e vo ke d lut g amat er e l eas esi nECandCAlr eg i o ns Bas al K十一 e vo ke d ECe vo ke dr e l eas esi nCAlr e g i o ns Bi c DNQX PMA - ` r r - 1 † 1 〔山 PMA CHR Fo r † † † 1 〔〔 H89 - DNQX PMA CHR Fo r Bi c ( Bi c ) Bi c+PMA Bi c+CHR Bi c+Fo r Bi c+H1 8 9 ( -) 〔､ L L † l 川) † 1 〔山 c+Fo r Bi c+H ( DNQX)Bi c+PMA Bi c+CHR Bi (山) 一一 (I) † 1 〔山一 o 営O ud 7 a s d a P 1-3C I uqnT f 5 0 三言 ⊇ 0 ≡ Conc e n t r a ion( t 岬 ) ( T f IC " 0 害 -8 9 5 q aS 21VEVD d ) 2 o … 一 2 2 4 o EVD 言山 H89 † ( f lo utO o u ′ hV 打 1 三 t rat io n( pM) H1 89 1 DNQX uo u d ) a 詔 a P 1 2 1 C u q n T g 1 d ) oua 0 s q2V e n † † 0 0 ( T 祁o ( T l ou 芸 Conc Fo r U Bi c gl ut amat e 〔 I nt e r ac t i o nbe t we e nBi candpr o t e n ki i nas e o nECe vo ke dr e l eas esi nCAlr e g l O nS GABA gl ut amat e I nt e r ac t i o nbe t we e nDNQXa ndpr o t e i nki nas e o nECe vo ke dr e l eas esi nCAlr e g l O nS GABA gl ut amat e 書 CHR ≡ 喜 ≡ ≡ ≡ … conc e n t r a ion( t p碕 ≡ o ; ≡≡ ≡… no n ( 両 con c etrat i Fi g.3 Efe c t so fi nhi bi t o r sandac t i vat o r so fpr o t e i nki nas eso nbas alr e l eas eso fGABA andgl ut amat ei n EC,do r s alandve nt r alhi ppo c ampa lCAlr e g i o n Thec o nc e nt r at i o nde pende nte fe c t so f l 89 ( c l os e ds m bo y l s )andCHR ( o pene ds m bo y l s )O nbas al GABAa ndgl ut amat er e l eas esi nEC ( t r i a ngl es ) ,do r s al( s quar e s)andve nt r al( c i r c l es )hi ppoc ampalCAlr e g i o nar eS ho wni nFi gur e s3Aand3B,r e s pe c t i ve l y.Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fec t so f Fo r( c l os e ds ymbo l s )andPMA ( o pe ne ds ymbo l s )o nt hebas alGABAa ndgl ut amat er e l eas esi nEC ( t iang r les ) ,do r s al( s quar e s )andve nt r al( c i r c l e s )hi ppo c ampalCAlr e io g nar es ho wni nFi gur es 3C and3D,r es pe c t i ve l y.Theo r di na t esi ndi c at et hemean ± SD ( N -6)o fe xt r ac e l l ul a rl e ve l so f GABAa n dgl ut na a t e( pmol / 20 / JI ),a n dabs c i s s ass ho wt hec o nc e nt r at i o no fage nt s (〟M).Thec o nc e nt r at i onde pe ndente fe c t so fH 89,CHR,Fo randPMAo nbas alr e l eas eso fGABAandg lut amat e we r ea nal yz e dus i ngr e peat e dmeas ur e me nt sANOVA andDunne t t ' smul t i pl ec o mpar i s o nt es t (*: P<0. 05;** : P<0. 01) . H 精神薬療研究年報第3 5集 2003年 3月 EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅴ および Ⅰ Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激で, pe r f br antpat hwayへの興奮伝播は全てのスライス 0 (t T i r nozno lJ)a S C a pat hwayへの興奮伝播および EC から CAlへの興奮伝播は検出されなかった.EC 第 Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ l 2 層の同時刺激で ,t r i s ynapt i cpat hwayへの興奮伝 0 2 播拡大が全てのスライスで生じ,一部のスライス 1 P,a T V uqn T B O ( l ユoz ;o ud)asa cp ,vqvD で検出されたが ,mos s yf ibe r,Sc haf F erc ol l at e r al ( 4/ 6) で EC から CAlへの興奮伝播拡大が生じた ( Fi g.lC). PKA 阻害薬 H89還流投与では,EC 第 I I ,I I I , Ⅰ Ⅴ 層の単独刺激,および EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ層および第Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激で pe r f br antpat h- - 喜 ■ ･･ ■ Co nc e n t r a io t n( p M) O ≡ 0 - wayへの興奮性伝播は生じなかった.PKC 阻害薬害 ■ ･･ ■ Co nc e n t r a io t n( ph t ) 0 _ Fi g.4 Efe c t so fi nhi bi t o r sandGABA Aa ndAMPA r ec ept o r so nゎas alr e l eas eso fGABA and gl ut amat ei nEC,do r s alandγe nt r alhi ppo c ampalCAlr e g l O n Thec o nc e nt r a t i o nde pe nde nte fe c t so fBi c ( c l o s e ds ymbo l s )a ndDNQX ( o pe ne ds ymbo l s )o nbas alGABAa ndg lut ama t er e l e as e si nEC ( t r i a ngl e s ) ,do r s al( s quar e s )and ve nt r al( c i r c l es )hi ppo c ampalCAlr e g io n ar es ho wni nFi g ur es4 A and4B,r es pec t i ve l y.Theo r di nat esi ndi c at et hemean ( SD ( N -6)o fe xt r ac e l l ul a rl e ve l so rGABA andgl ut amat e( pmo l / 20〟わ,andabs c i s s ass ho wt hec o nc e nt r at i o noragent s ( 〟M) . Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t s o fBi ca ndDNQXo nゎas alr e l e as e so fGABAandg l ut ama t ewe r ea na l yz e dus l ngr e peat ed meas urement s ANOVA and Dunne t t ' smul t i pl ec ompar i s o nt es t (*: P<0. 05;** : P<0. 01 ). CHR 還流投与では,EC 第 ⅠⅠ,Ⅰ Ⅰ Ⅰ,Ⅰ Ⅴ 層の単独刺激および,EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅴ 層･Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ 層の同 r f br antpat hwayへの興奮伝播は生じ時刺激で pe なかったが ,EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ層 ( 3/ 6)および第 I I+ I I I+ I V層 ( 5 / 6)の同時刺激で perf orant pat hwayへ限局した興奮伝播が一部のスライスで検出された. ECH 興奮性伝播に対する GABA A受容体と pr o･ t ei nki nas eの相互作用 Bi c( 1 〟M) 還流投与による GABA A受容体機能抑制環境下での PMA 還流は,EC 第 Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ層同時刺激による t is r ynapt i cpat hwayへの興奮伝播が全スライスで観察され ,興奮伝播を克進した ( Fi g.2A). 同様に,EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ 層同時刺激による t is r ynapt i cpat hwayへの興奮伝播が全スライスで観察された ( Fi g.2A) . しかし,EC から CAlへの直接的興奮伝播は全てのスライスで観 Fi g.2A). 同環境下における察されなかった ( CHR は,EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅰ Ⅰ層同時刺激による興奮伝なかった. Adenyl ylc yc l as e作動薬 Fo r還流投与では,EC r f br antpat hwayに限局し,CHR は t r i s y播は pe napt i cpat hwayにおける興奮伝播を抑制した第Ⅰ Ⅰ層或いは第 Ⅰ Ⅰ Ⅰ層の単独刺激で perf orant ( Fi g.2A). しかし,Bi c還流で検出出来なかった pat hwayの興奮伝播が全てのスライスで生じたが EC から CAlへの直接興奮伝播は,Bi c+CHR で ( Fi g.lC),EC 第 Ⅰ Ⅴ 層単独刺激では pe rf br ant 一部のスライス ( 3/ 6) で生じた. EC 第 ⅠⅠ+ pat hwayへの興奮性伝播は生じなかった. EC 第 Ⅰ+Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激による興奮伝播も,CHR還 Ⅰ Ⅰ I I+I I I層の同時刺激で ,pe r f o r antpat hwayから, r f br antpat hwayへ流により全てのスライスで pe mos s yf i be r,Sc haf F e rc o l l at er alpat hwayへの興は興奮伝播は生じたが, mos s yf i ber,Sc haf f er 奮伝播が一部のスライス ( 3/ 6)で生じたが ,EC col l at eralpat hwayへの伝播は一部のスライスから CAlへの興奮伝播は生じなかった ( Fi g.lC). ( 3 / 6) となり tris ynapt i cpat hwayへの興奮伝播は第3 5集精神薬療研究年報 2003年 3月 81 0 4 0 2 Wqn T B ≡ ≡ ; ⊇ ≡ Conc e n t r a io t n( p M) 0 I ･ ■ n TB 害 J a tt D 0 l aPIVqV SV 0 l , a TV tu q 2 ⊇ (t 0 0 aP SV D 言 Co nc e n t r a i t o n( pM ) T lがnou d)a S V aP (t N T loN n N u od)a (t ユonSTud)a V a 曾 oN O nu Od) a S P?V qV 0 害 ≡ 三喜 ≡ ≡ ≡ … Conc e n t r a don( 南 ≡ 喜 ≡ : - ≡ … Conc e n t r a io t n( 両 Fi g.5 Efe c t so fi nhi bi t o r sandac t i vat o r so fpr o t e i nki nas e so nK' e vo ke dr e l e as e so fGABAandgl ut amat e i nEC, do r s a landγe nt r a lhi ppo c ampalCAlr e gl O n Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t so fH l 89 ( c l o s e ds m bo y l s )andCHR ( o pe ne ds m bo y l s )o nK'e vo ke dGABA andgl ut amat er e l eas e si nEC ( t r i angl e s ),do r s al( s quar e s )andγe nt r al( c i r c l e s ) hi ppo c ampalCAlr e gl O nar eS ho wni n Fi g ur e s5 Aa n d5 B, r e s pe c t i ve l y. Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nt e vo ke dGABAandg lut a mat e e fe c t so fFo r( c l o s e ds m bo y l s )andPMA ( o pe ne ds m bo y l s )o nt heK' r e l eas e si n EC ( t r i angl e s ) ,do r s al( s quar e s )andγe nt r al( c i r c l e s )hi ppo c ampalCAlr e gi o nar e s ho wni nFi g ur e s5Cand5D,r e s pe c t i ve l y.Theo r di nat e si ndi c at et heme a 皿 ±S D( N - 6)o fKーe vo ke dr e l e as e so fGABA andgl ut amat e( pmo l / 20〟l ),a ndabs c i s s ass ho wt hec o nc ent r at i o no f a ge nt s( 〟M).Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t so f 89,CHR,Fo randPMAo nbas alr e l e as e so f GABAa n dg lut amat ewe r eana l yz e dus l ngr e pea t e dme as ur e me nt sANOVAandDunne t t ' smul t i pl e c o mpa r i s o nt e s t(*:P<0. 05;**:P<0. 01 ) . H 抑制されたが ( Fi g.2A),EC から CAlへの直接 Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激による興奮伝播も,全てのスライ興奮伝播は全てのスライスで観察され,興奮伝播 f orantpat hwayへは興奮伝播はしたが, スで per Fi g.2A) の拡大が生じた ( mos s yr l be r,Sc haf f e rc ol l at e r alpat hwayへの伝 . Bi c (1 〟M) と Forの還流投与では ,Ec 紫播は一部のスライス ( 3/ 6) のみであり,EC から Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ層同時刺激による興奮伝播は,全てのスラ CAlへの興奮伝播も一部 ( 2/ 6) で観察されたに過 orantpat hwayから moss yf i ber, イスで perf Fi g.2B). ぎなかった ( Sc haf f erc ol l at e ralpat hwayへの興奮伝播が検出 EC ･海馬神経伝達物質基礎遊離に対する GABAA され,一部のスライス ( 2/ 6) で EC から CAlへの受容体･prot ei nki nas eの効果 EC,腹側･背側海馬 CAl領域の基礎･K 十刺激 Fi g.2B).EC 第 Ⅰ Ⅰ+ⅠⅠ Ⅰ+ 興奮伝播が生じた ( Ⅰ Ⅴ 層の同時刺激による興奮伝播も増強され,全て ut amat e遊離,そして EC における性 GABA ･gl orantpat hwayから mossy のスライスで perf K+ 刺激性腹側海馬 CAl領域 GABA ･gl ut amat e f i be r,Sc haferc ol l at er alpat hwayおよび EC か遊離に対する,GABA A受容体阻害薬,AMPA 受容ら CAlへの直接興奮伝播が観察された ( Fi g.2B) 体阻害薬 ,PKA作動薬 ,PKA 阻害薬 ,PKC作動 H89は,EC 第 Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ層同時刺激による興奮伝薬 ,PKC 阻害薬の効果を Tabl e2にまとめた. . 5/ 6) で per f brant 播を抑制し,一部のスライス ( Fi g.2B).EC 第 Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ+ pat hwayに限局した ( EC の g lut m at a e.GABA 基礎遊離濃度は 0. 32± 0. 04 ･0. 04 ± 0. 01pmo l / 20〟lであった.腹側海精神薬療研究年報第3 5集 2003年 3月 82 腹側･背側海馬 CAl領域の GABA 基礎遊離は抑制されたが, その抑制効果は CHR優位であった (t7] ONn O u 0ノの抑制効果は CHR が H89よりも優位であった ( Fi g.3B).For･PMA は EC ･腹側および背側 ut amat e基礎遊離を海馬 CAl領域の GABA ･gl ∠ U 3 2 7 t ! uqn t 的 aP 1 ∠U t !aa d ) 3詔 0 ノ OJ ( tTJ O N nOt u d )aS PI V g V 2 1 ( Fi g.3A).H 89 ･CHR は gl ut amat e遊離には効果がなかったが,GABA 基礎遊離を抑制し,そ克進した ( Fi g.3C,3D). この基礎遊離克進効果は,GABA に対しては PMA の克進効果は Forよ D Fi g.3C),逆に,gl ut amat e りも優位であったが ( に対しては,Fo rの克進効果は PMA よりも優位で Fi g.3D) .Bi cは EC ･腹側および背側海あった ( ⊂ ) ' - ⊂ 〉 ⊂ ⊂ 〉一一〉 ■ Co nc e ntra t i Qn( I I M) ⊂〉 ' ･ - ⊂ 〉 ■ ■ - Co nc e n t r a io t n( I I M) Fi g.6 Efe c t so fi nhi bi t o r sandGABA Aa ndAMPA r ec e pt o r so nK一一 e vo ke dr e l eas eso fGA玉A andgl ut amat ei nEC,dor s alandvent r al hi ppo c ampalCAlr e gl O n Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t so fBi c ( c l o s e ds ymbo l s )andDNQX ( o pe ne ds ymbo l s )o nK一一 e vo ke dGABA andgl ut amat e r e l e as e si nEC ( t iang r le s ) , do r s al( s quar e s ) a ndve nt r a l( c i r c l e s )hi ppo c ampalCAlr e io g nar es ho wni nFi g ur e s6 A and6B,r eTheo r d i na t e si nd i c a t et heme n ± a S ec p t i ve l y. SD ( N -6)o fKLe vo ke dr e l e a s e so fGABA ),a ndabs c i s I andg lut amat e( pmo l / 20〟l s a BS ho wt hec o nc e nt r a t i o no fa ge nt s( 〟M) . Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t so fBi c n dDNQXo a nK' e vo ke dr e l e as e so fGABA n dg a lut amat ewe r eanal yz e dus l ngr e Pe at e dmeas ur e me nt sANOVA andDunne t t ' s *: P<0. 05;** : mu lt i p l ec o mpa ri s o nt e s t( P<0. 01 ) . 馬 CAl領域の gl ut amat e細胞外濃度を増加したが ( Fi g.4B),GABA 濃度には効果がなかった ( Fi g. 4A).AMPA 受容体阻害薬 DNQX は EC ･腹側海 uta馬および背側海馬 CAl領域の GABA ･gl Fi g. mat e細胞外濃度に対して効果はなかった ( 4A,4B). EC ･海馬神経伝達物質 K+刺激性遊離に対する GABA A受容体･prot ei nki nas eの効果 EC の K◆ 刺激性 gl ut amate ･GABA 遊離は 0. 90± 0. 1 9 ･0. 24± 0. 08pmo l / 20F Llであった. 腹側海馬 CAl領域の gl ut amat e IGABA K+ 刺激性遊離は 2. 58± 0. 39 ･0. 84 ± 0. 12pmol / 20 F Ll であった.背側海馬 CAl領域の gl utamat e･刺激性遊離は 1. 47 ± 0. 21 ･0. 65 ± GA玉A K･ 0. 09pmo l / 20F Llであった. H89 ･CHR は 50mM K 刺激性 GABA ･ gl ut amat e遊離を抑制したが,その抑制効果は HFi g.5A,5B). 89が CHR よりも優位であった ( For ･PMA は EC ･腹側および背側海馬 CAl領刺激性 GABA ･gl ut amat e遊離を域の 50mM K- 馬 CAl領域の gl ut amat e ･GABA 基礎遊離濃度克進し,Forの克進効果は PMA よりも優位であっは 0. 74± 0. 09 ･0. 1 8± 0. 02pmo l / 20 F Llであっ Fi g.5C,5D).Bi cは EC ･腹側および背側海た ( ut amat e ･GABA 基た.背側海馬 CAl領域の gl 刺激性 GABA を軽度克馬 CAl領域の 50mM K- 礎遊離濃度 0. 50± 0. 05 ･0. 08± 0. 01pmo l / 20F L ut amat e遊離を克進した ( Fi g.6A ,6B). 進し,gl Jであった.各領域の gl ut amat e基礎遊離はナトリ DNQX は EC ･腹側海馬および背側海馬 CAl領域 et rodot oxi n( TTX)還流おウムチャネル阻害薬 t の 50mM K刺激性 GABA を軽度抑制し,逆によび Ca2十f r eeMRS還流による減少は認められな gl ut amat e遊離を軽度克進した ( Fi g.6A,6B) . かったが,GABA 基礎遊離は 50%以下に減少した. PKC 阻害薬 CHR ･PKA 阻害薬 H89は EC, EC 刺激性による海馬 CAl神経伝達物質に対す ot ei nki nas eの効果る GABA A受容体･pr EC挿入 pr o beを用いた 50mM K十還流刺激によ第3 5集精神薬療研究年報 2003年 3月 83 0 0 0 0 0 p I ′ h V 0 VqV 茎富 g l ut a ma t er e l e a s e( p mol / 2 0pl ) ⊂ > N 寸＼､ ○ 0 ー n T 的 D ≡ )⊂ ). ⊥ ) ⊂) ⊂ 0 去Nu q ノ a s ｡ a 岩 ⊂ )･ ⊂ )O ⊂ ) ⊂ ) ⊂ ) P q q O . ･ r _0 . 0 .0 ′ o c ｡ n o wo . m b T . 言孟喜ま c｡ n ow o. mこn :p o ⊂ )⊂ ( ･ ) x ONQP!q o 守 o NnguJ d)s a vr n ,p 5 2 1 1 (TTt N nO ud) 茎 GABAr e l e a s e( pmol / 2 0ト 1 1 ) ⊂ ) N 寸＼､000 ⊂〉島 Fi g.7 Efe c t so fi l1 n i bi t o r so fGABAA , AMPAr ec e pt o r s ,pr ot e i nki nas esandac t i vat o r so fpr ot e i nki nas e so n r e l e as e so rGA玉Aandgl ut ama t ei nve nt r alhi ppo c ampalCAlr e gl O nSi nduc e dbyK十一 e vo ke ds t i mul at i o ni nEC 89 ( ● ),CHR ( ○ ),Fo r( I),PMA ( □),Bi c( ▲ )a nd Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t so f DNQX ( A) o nr e l e as e so fGABAandg lut amat ei nve nt r alhi ppoc ampalCAlr e io g nsi nduc e dby50 mM K一一 e vo ke ds t i mul at i o ni nECar es ho wni nFi gur es7 Aand7B,r es pec t i ve l y.Theo r di nat esi ndi c at et heme an± SD ( N -6)o fr e l e as eso fGABA andgl ut amat e( pmol / 20F Ll )af te rK. e vo ked s t i mul a t i o ni nEC,a ndabs c i s s ass ho wt hec o nc e nt r at i o no feac hage nt s(〟M).Thec o nc e nt r at i o nde pe nde nte fe c t so f 89,CHR,Fo r ,PMA,Bi ca n dDNQX o nr e l e as eso fGABA andg lut amat ei n ve nt r a lhi ppo c ampalCAlr e g i o nsi nduc edby50mM K' e vo keds t i mul at i o ni nECwe r eanal yz edus i ngr e pe at e dme as ur e me nt sANOVA n a dDu n ne t t ' smul t i pl ec ompar is o nt es t( *: P<0. 05;** : P<0. 01 ) .Thei nt e r ac t i o nbe t we e ni nhi bi t o r so fGABA A ,A MPAr e c e pt o r sandi nhi bi t o r s ,ac t i vat o r s o fpr o t e i nki nas eo nr e l e as e so fGABAandg lut amat ei n ve nt r alhi ppo c ampalCAlr e g i o nsi nduc e dby K' e vo ke ds t i mul at i o ni nECa r es ho wni nFi gur es7Ca n d7D,r e s pe c t i ve l y.Theabs c i s s asi ndi c at e t hemea n + - SD ( N -6)o fr e l e as e so fGABAandg lut amat ei nve nt r alhi ppo c ampalCAlr e io g nsi nduc e db yK ' e vo ke ds t i mul at i o ni nEC.Thee fe c t so fH1 89,CHR,Fo ra n dPMAo nr el eas esofGABA andg lut amat ei nve nt r a lhi ppo c ampalCAlr e gl O nSi nduc edbyK. l e VO ke ds t i mul at i o ni nEC,unde r t hec o ndi t i o no fbl o c kadeo fGABA AO rAMPAr ec e pt o r s ,we r eanal yz edus i ngO neWayANOVA and Tuke y' smul t i pl ec o mpar is o nt e s t( *: P<0. 05;** : P<0. 01 ) . H H って,腹側海馬 CAl領域の細胞外 gl ut amat e･ 89 制したが,その抑制効果は GABA とは逆に H- GABA 濃度は,1. 1 6± 0. 09 ･0. 58± 0. 07pmoV20 が CHR よりも優位であった ( Fi g.7B).EC刺激〟J増加したが,背側海馬 CAl領域の細胞外 GA- 性腹側海馬 CAl領域の GABA 遊離増加を,腹側 BA ･gl ut amat e濃度は変化なかった. 海馬 CAl領域における PMA ･For還流投与は克 EC刺激性腹側海馬 CAl領域の GABA 遊離増加進したが,その克進は PMA が Forよりも優位でを,腹側海馬 CAl領域における H89 ･CHR 還 Fi g.7A).EC刺激性腹側海馬 CAl領域あった ( 流投与は抑制したが,その抑制効果は CHR が H- の gl ut amat e遊離増加を,腹側海馬 CAl領域にお Fi g.7A).EC刺激性腹 89よりも優位であった ( ける PMA ･For還流投与は克進したが,その克側海馬 CAl領域の gl ut amat e遊離増加を,腹側海 Fi g.7A). 進は Forが PMA よりも優位であった ( 馬 CAl領域における H89 ･CHR 還流投与は抑 EC刺激性腹側海馬 CAl領域の GABA 遊離増加に精神薬療研究年報第 3 5集 200 3年 3月 84 対して,腹側海馬 CAl領域 Bi c還流投与は効果がの制御機構と同様に 15 ' ,基礎遊離は,gl ut amat e なかった,g l ut amat e遊離増加は克進した.DNQX 遊離とは逆に PKC による制御を PKA よりも優位は GABA 遊離を抑制したが ,gl ut amat e遊離を逆に受けていたが ,50mM K･刺激性遊離は逆に, に克進した ( Fi g.7 A,7B). PKC よりも PKA による制御を優位に受けていた. EC 刺激性による海馬 CAl神経伝達物質に対す l ut ama t e ･GABA遊離に対する pr o t e i nki この g ot ei nki nas eの相互作用る GABA A受容体と pr nas eの制御は部位特異性を認めず,EC,腹側･背 Bi c還流による腹側海馬 CAl領域 GABA A受容側海馬で同様の感受性特性を示したことから, こ体機能抑制環境下における pr o t e i nki nas eの効果は,GA玉A ･gl ut amat e遊離を PMA ･Fo rは克 ut amat eとの実験結果は中枢神経系内における gl GABA 開口分泌機構の特性を示すものと予想され進し,GABA 遊離克進作用は PMA が Fo rよりもる. Fi g.7C),gl ut amat e遊離克進効果優位であり ( GABA の開口分泌が,モノアミン同様に,基礎 rが PMA よりも優位であった ( Fi g.7D).同は Fo 遊離と脱分極性遊離で異なる機構で制御されてい環境における CHR ･H89は,GABA ･gl ut a- たことから,GABA 開口分泌には,神経細胞の過 mat e遊離を抑制したが,GABA 遊離抑制作用は剰興奮によって生じる開口分泌機構と自発性遊離 CHRが H89よりも優位であり ( Fi g.7C),gl u89が CHR よりも優位 t amat e遊離克進効果は H- を司る機構の異なる開口分泌機構によって制御されている可能性が示唆される.一方 ,gl ut amat e Fi g.7D) . であった ( の基礎遊離は,TTX,Ca2- f r ee透析液還流に対し DNQX還流による腹側海馬 CAl領域の AMPA て非感受性を示したが,逆に脱分極性遊離は,GA- 受容体機能抑制環境下における pr o t e i nki nas eの BA 同様に PKA優位の制御を受けていた. この結 ut amat e遊離を PMA ･Fo rは克進し, 効果は,gl ut amat eの自発性遊離機構の欠如を意味果は,gl Fo rの克進効果は PMA よりも優位であった ( Fi g. r遺 7D). しかし,同環境下において,PMA ･Fo するのか,マイクロダイアリーシスを用いた細胞 Fi g.7C). 流は GABA 遊離には効果がなかった ( な問題か否かは今後の検討が必要ではあるが,少また,DNQX 還流による AMPA 受容体機能抑制なくとも GABA と比較すると, 自発性遊離機構を 89は,gl ut amat e遊離を抑環境下で,CHR ･H- 介した開口分泌される gl ut amat e濃度は低いもの制したが,H89の抑制効果は CHR よりも優位でと推定される 14). 間隙に存在する神経伝達物質の回収自体の手技的あったが ,GABA 遊離には効果がなかった ( Fi g. EC から海馬への投射経路の横能的検討 7C,7D) . 第二は,解剖学的な知見である.組織学的な検考察 Ⅰ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ層から CAl領域の pyr a討から,EC 第 Ⅰ mi dalc e l lへの投射は確認されていた2 2 ' 2 7 ) . しかし, EC ･海馬における神経伝達系の主要抑制性機構この経路の伝達系の機能的証明は未だになされてが GABA系であることは,既に二次元画像解析に i c al MED とマルチプローブマイいなかった.Opt よって 8)証明されていたが,本研究結果もこの報告クロダイアリーシスを用いた本研究結果から,EC を支持する.本研究は, この他に新たな 3つの知から海馬への入力は少なくとも腹側海馬において見を得た. は明らかに機能的に存在し,背側海馬ではその入 EC ･海馬の神経伝達物質遊離横構力は確認に至らなかった. 第一は,EC ･腹側･背側海馬における開口分泌 Opt i c al MED を用いた検討では,EC 第 Ⅰ Ⅰ+ Ⅰ Ⅴ ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅴ層同時刺激と Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ層の同時刺激はg l ut amat eと GABA では異なる薬理学的特性を有する機構によって制御されていたことである. EC,腹側･背側海馬 CAl領域の gl ut amat e遊離は,PKC よりも PKA による制御を優位に受けていた.一方,GABA 遊離は,海馬モノアミン遊離では EC から腹側海馬への興奮伝輝は,明らかに Ⅰ Ⅰ+Ⅰ Ⅰ Ⅰ層同時刺激が有意に興奮伝播面積が広汎であった.以上の結果は,EC から腹側海馬 CAl領域への入力は, EC 第 Ⅰ Ⅰ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ層から DG への精神薬療研究年報第3 5集 2003年 3月 85 per f br antpat hwayが主要入力系であり,EC 第 Ⅰ Ⅴ 層からの入力は補助的な機能を果たしているに GABA 遊離は ,EC からの興奮性入力を受けない cによる GABA A受容体機能過ぎない. しかし,Bi 方,腹側海馬 CAl領域の EC刺激性 g l ut amat e遊抑制環境下において ,EC第 Ⅰ Ⅴ 層の刺激が加わる cによる GABA受容体機能抑制 ,DNQX 離は,Bi ことで ,t r i s ynapt i cpat hwayに加えて ECからによる AMPA 受容体機能抑制環境下においても CAlへの直接投射を介した興奮伝播は劇的に増強 pr ot ei nki nas eに対する感受性特性は変わらず , Ⅴ 層から海馬へしたことから,少なくとも EC第 Ⅰ Bi c･DNQX により遊離増加したことから,EC から腹側海馬 CAl領域への投射は少なくとも, の入力は, GABA A受容体による抑制を ,EC 第 Ⅰ Ⅰ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ層よりも優位に受けている可能性が示唆される. マルチプローブマイクロダイアリーシスを用い Ⅰ･た神経伝達物質遊離の検討では, EC (第 Ⅰ Ⅰ ･Ⅰ Ⅴ 層を含む) に挿入したプローブを 5 0mM Ⅰ Ⅰ 自発性遊離機構を有する可能性が示唆される.一 CAlpyr ami dalc e l lへ直接興奮性投射する経路と, GABA 介在神経へ投射し,抑制性制御を発現する投射に分岐している可能性が示唆される. まとめ K十刺激により GABA ･gl ut amat e遊離が増強し本研究は,EC から腹側海馬 CAl領域への直接 lut amat eで反応たが, この遊離増強は GABA と g 投射を機能的に証明し, その神経伝達機構の薬理が異なった.GABA受容体抑制により gl ut amat e 学的特性も明らかにした.EC第 Ⅰ Ⅰ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ･Ⅰ Ⅴ層遊離が増強したにもかかわらず, GABA 遊離の増から腹側海馬 CAl領域への投射は,直接投射する強は認められなかった.一方 ,AMPA 受容体阻害興奮性投射と,介在神経へ興奮性投射した結果とによって,GABA 遊離は増強したにもかかわらず, して CAl領域の興奮性を抑制する間接的抑制性投 gl ut amat e遊離は逆に軽度増強した. この結果は, Ⅴ 層か射の存在が明らかとなった. また .EC第 Ⅰ EC から腹側海馬 CAl領域への投射は,興奮性の Ⅰ･Ⅰ Ⅰ Ⅰ層と比較し GABA にらの入力は,EC 第 Ⅰ gl ut amat e系神経の直接投射と,gl ut amat e作動性 GABA介在神経への投射が混在している可能性 ut amat e神よる抑制を強力に受けていた. この gl 経系の投射線維からの gl ut amat e開口分泌機構はを示唆する. しかも, この g l ut amat e作動性 GA- 少なくとも,PKA による細胞内情報伝達系機能の BA 介在神経は ,CAlへの直接投射を抑制性に制制御を受け, この機構は過剰興奮時も同様の機構御しているものと考えられる. によって制御されていた. 一方,介在神経の GA- EC から海馬 CAl領域への直接投射の伝達機構 BA 開口分泌機構は ,PKC による制御を受けたの薬理学的検討 ECからの興奮性投射を受け発現する機構と自発性第三は, この EC刺激性腹側海馬 CAl領域神経伝達物質遊離機構の薬理学特性である.EC刺激性の腹側海馬 CAl領域の GABA 遊離は,DNQX による AMPA受容体阻害によって劇的に減少し, し o t e i nki nas eの影響を受けかも同環境下では,pr なかった. これらの結果から,ECからの興奮伝播によって生じる GABA 遊離の増加は,EC からの gl ut amat e系神経の投射を受けた介在神経から遊離されているものと予想される.加えて ,DNQX 前処置時,腹側海馬 CAl領域の GABA 基礎遊離 rによって増加し,CHR と H89には PMA ･Fo よって抑制されるにもかかわらず ,EC刺激性遊離 o t e i nki nas e阻害薬･作動薬に感増加はこれら pr 受性を示さないことから,腹側海馬 CAl領域の開口分泌機構と PKA優位の脱分極誘発性開口分泌機構によって制御されていた. 文献 1 )A lbr ig h tTD, J e s s e l l TM,Ha nde l ER,a ndPos ne r MI .Ne ur a ls c i e nc e:ac e nt uI YO fpr o gr es sa nd l l , 2000;1 8: Sl∼ t hemys t e ie r st ha tr e ma in. Ce S5 5 . 2)A nd e r s o nP, Bl i s sTVP, ndSkr a e deK KI m e na r Or ga ni z a t i onofhi ppoc a mpa le xc i t a t or ypa t hwa ys . ExpBr a i nRe s ,1 971;1 3: 2 2 2- 2 3 8. 3)Ba r Ga d∫ , a ndBe r gma nH.St eppi ngouto ft he bo x:i nf om a t i onpr o c e s s i ngi nt hene ur a lne t wor ksoft heba s a lga ngl i a .Cur rOpi nNe ur obi o l , 2001;l l: 6 8 9- 6 9 5. 4)Ca s i t noPE, We i s s ko p fMG, a J l dNi c o l l RA.′ m er o l e 精神薬療研究年報第 35集 2 00 3年 3月 86 ofCa 2ー c ha nnel si nhi ppoc a mpa lmos s y丘be r s yna pt i ct r a ns mi s s i ona ndl ongt er m pot e nt i a t i o n. Ne ur o n,1 994;1 2: 261- 26 9. bkeJ I ,a ndTur ne rTJ .Exo c y t ot ic 5)Dunl a pK,Lue Ca 2ーc ha nne l si nma mma l i a nc e nt r a lne ur ons . Tr e nds . Ne ur os c i ,1 995; 1 8: 8 9- 9 8. 6)Gl o ve l i T, Sc hmi t zD,a ndHe i ne ma nnU. I nt e r a c io t nbe t we e ns upe r ic f i a ll a ye r so ft hee nt o r hi na lc or t e xa ndt hehi p poc m pusi a nnor ma la nd e pi l e pt i ct e mpo r a l l o be. Epi l e ps yRe s ,1 998; 3 2: 1 8 3- 1 9 3. ,a ndJ e uneB.0r ig ina ndt e r 7)Hj or t hSi mo ns e nA mi na t i o no ft hehi ppo c a mpa lpe r or f a ntpa t hi n t her a ts t udi e dbys i l v e ri mpr e gna t i o n. ∫Co mp Ne ur o l ,1 972; 1 4 4: 21 5- 2 3 2. 8 )I i j i maT, Wi 仕e rMP,I c hi ka waM, Tomi na gaT, bj i wa r aR,a ndMa t s umo t oG.Ent or hi na l hi p poca mpa li nt er a c t i onsr e vea l edbyr ea l t i me i ma g l ng. S c i e nc e,1 996; 2 7 2:1 1 7 6- 1 1 7 9. wa t aY, Oka daM, Murakam i T,Ka ma t aA ,Zhu 9)Ka G,a ndKa ne koS.Pha ma c ol o gi c a ldi s c r i mi na t i o nbe t we e ne fe c t so fc a r ba ma z e pl neOnhi p po c a mpa lba s a l ,Ca 2+- a ndK十一e v o ke ds e r o t o ni n r e l e a s e. BrJPha ma c ol , 2001;1 3 3: 5 5 7- 5 6 7. 1 0)Mo is m o nJ H, ndHo a fPR.Li f ea ndde a ho t fne ur onsi nt hea gl ngbr a i n.Sc i enc e,1997;278 ( 5 3 3 7 ): 41 2- 41 9. ll)Mur a kamiT,OkadaM,Ka wa t aY,ZhuG, Ka ma t aA ,a ndKa ne koS.De t e mi r na t i o no fe f f e c t so fa nt ie p i l e p t i cdr ugso nSNAREs me di a t e d hi ppo c a mpa lmonoa mi ner e l e a s eus l ngi nv i v o mi c r odi a l ys i s .Br∫Phm a c o l ,2001;1 3 4:5 07 -5 2 0. 1 2)OkaH,Shi mo noK,Oga waR,Sug iha raH,a nd Ta ke t a niM･Ane wpl na a rmul ie t l e c t r odea r r a y ore f xt r a c e l l ul a rr e c o r di ng:a ppl i c a t i ont ohi p po c a mpa la c ut es l i c e . ∫Ne ur o s c iMe 仇ods ,1 999; 9 3: 61- 6 7. r yuK ,Ka wa t aY,Mi z uno 1 3)Oka daM, Wa daK,Ki K,Ro ndoT, Ta s a kiH,a ndKa ne koS.Efe c t so f Ca 2▲ c ha nne la nt a goni s t sons t ia r t l dopa a mi ne a ndDOPAr e l e a s e,s t udi e dbyi nv i v omi c r od i a 1 ys i s . BrJPhm a c o l , 1 998; 1 2 3: 8 05- 81 4. wa t aY, Mi z unoK, Wa daK, Ko ndo 1 4)Oka daM,Ka T,Ka ne koS.Ⅰ nt e r a c t i o nbe t we e nCa 2+, K一 ,c a r ba ma z e pi nea ndz o ni s a mi deonhi ppo c a mpa le xt r a c el l ul a rgl ut a ma t emoni t or edwi t hami c r odi a l ys i se l e c t r ode.Br∫Pha ma c o l ,1 998;1 2 4: 1 2 7 7- 1 2 8 5 . Mur a ka mi T,ZhuG,Ka ma t a 1 5)Oka daM, Nut tDJ, A,Kawat aY,a ndKa ne koS. Ade nos i ner e c e p t o r - s ubt ypesmodul a t et woma j orhnc t i ona lpa t hwa ysf o rhi p po c a mpa ls e r o t o n hr e l e a s e. ∫Ne u r o s c i , 2001; 21: 6 2 8- 6 40. 1 6 )Oka daM,ZhuG, Yos ha daS,Ka I l a iK,Hi r os eS, a ndKa I l e koS.Exo c y t os i sme c ha ni s ma sane w t ∬ge t i ngs i t ef orme c ha ni s mso fa c t i o no fa nt i ,( i npr e s s ) . e pi l e pt icdr ugs . Li f eS c i 1 7 )Oka daM,ZhuG,Wa kuiM,I t oK,Ka ne koS, Yos ha daS,Ka na iK,Hi r os eS,a ndKa ne koS. 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Na 山r e,1 993; 36 6: 1 5 6- 1 5 8. 2 2)Ta ma m a k iN, ndNo a j yoY.Pr o j e c io t no ft hee nt or hi na ll a ye rI Ine ur onsi nt her a ta sr e v e a l e d byi nt r a c e l l ul a rpr es s ur e Jnj ec t i ono fne ur o bi 8 0. ot i n. Hi ppo c a mpus ,1 993; 3: 471- 4 2 3 )To i na m gaT, To l ni na gaY, Ya ma daH, Ma t s mo u t o G,a ndI c hi ka waM.Qua nt if ic a io t no fo pt ic a ls i gna l swi t he l e c t r o phys i o l o ic g a ls i g na l si nne ur a l a c t i it v ie so fDi 4 ANEPPSs t ine a dr a thi p poc ma pa ls l i c e s .∫Ne ur os c iMe t hods ,2000;1 0 2:l l -2 3. 2 4)To i na m gaT, Tom i na gaY, ndI a c hi ka waM. Si mul t a ne o usmul it s i t er e c o r di ngso fne ur a la c iv t it y wi t ha ni nl i nemul t i e l e c t r odea r r a ya ndo pt ic a l Pf luge r s me a s ur e me nti nr a thi ppo c a mpa ls l i c es . Ar c h, 2001; 4 4 3: 31 7- 3 2 2. 2 5 )Vi daI ,a ndFr o t s c he rM. Ahi ppo c m pa a li nt e me ur o na s s oc i a t e dwi t ht hemos s y丘be rs ys t e m. Pr ocNa t lAc adS° iUSA,2000;97:1 2751 2 8 0. nda l l A,a ndTs i e nRW.Ro l e so f 2 6 )W h e e l e rDB,Ra Nypea t ndQypeCa t 2ー c ha nne l si ns uppo r t i ng hi ppoc a mpa ls yna pt i ct r a ns mi s s i on.Sc i ence, 精神薬療研究年報第 35集 200 3年 3月 87 1 994; 2 6 4:1 0 7- 1 11 . 2 7)Wi t t e rMP, Wo ut e r l oodFG,Na be rPA,a ndVa n na A t omi c a lo r ga ni z a t i ono ft hepa r a Ha e Re nT. hi ppocampa 1 hi ppoc ampa lnet wor k.A n nNY Ac a dS ci , 2000; 91 1:1- 2 4. 28)ZhuG,OkadaM,Mur akamiT,Kama t aA, Ka wa t aY,Wa daK,a ndKa ne koS.Dys f unc t i o n o fMI Cha nne le nha nc espr o pa ga io t no fne ur ona l e xc i t a bi l i t yi nr a thi ppoc a mpusmoni t or edby mul t i e l e c t r odedi s ha ndmi c r odi a l ys i ss ys t e ms . iL et t , 2000; 2 9 4: 5 3- 5 7 . Ne ur os c ABSTRACT Det ermi nat i onoft rans mi s s i onmechani s msi ndi r ect pr o j ect i onf rom ent or hi na l cort ext o vent ra l hi ppocampalCAlregi onus i ngm u l t r oopt i ca li magl ngandl nul u omul t i pr obemi ･ cr odi al ys i smet hods Mo t o hi r oOKADA* ,GangZHU* ,ShukukoYOSHI DA* * ,Kaz uakiKANAI * ,SunaoKANEKO* * Depar t me nto fNeur ops yc hi at r y,Sc hoo lo fMe di c i ne,Uni ve r s i t yofHi r os aki ,Hi r os aki0368562, Japan. ** I ns t i t ut eo fNeur os c i e nc eandMo l e c ul arBi o l o gy,Shi bat aBI OTEC,Hi r os aki0368084, Japan. Toc l a if r yt hene ur o t r ans mi s s i o nme c hani s mso fe nt o r hi na1 c o r t e x( EC) nl i ppo c ampalpa t hwa y,we de t e r mi ne di nt e r ac t i o nbe t we e nGABAA ,AMPAr e c e pt o r sandpr o t e i nki nas eac t i v i t i eso npr o paga t i o n o fne ur o nal e xc i t abi l i t y,ande xo c yt o s i so fGA玉Aandgl ut ama t e,us i ngvi s ual i z i ngmo ni t o r i ngandmul t i pr o bemi c r o di al ys i ss ys t e ms ,r es pe c t i ve l y.Thegl ut amat ee xo c yt os i si sr e gul at e dbyPKApr e do mi nant l y,whi c hi spa r t i a l l yi nhi bi t e dbyGABAe r ics g ys t e m.TheGABAe xo c y t o s i si sr e g la u t e dbyPKC pr e do mi nant l y,whi c hi spr o mo t e dbyg lut ama t e r ics g ys t e m.Theve nt r alhi ppo c ampalpyr ami dalc e l l s i nCAlr e io g nwe r epr o j e c t e df ro m bo t hs upe r ic f i al( ECI IandI I Il a ye r s )andde e pe r( ECI Vl a ye r ) l aye r s.Thes epat hwaysar emai nl ye xc i t at o r ygl ut amat er icpr g o j ec t i o nsbutpar t i al l ypr o j ec t st o GABAe r g l Ci nt e ne r ur o ns , whi c hwe r epr o j e c t e df ro m EC. 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