平成２２年度・先端計測分析技術・機器開発事業 （要素技術プログラム） ウイルス感染感受性および ワクチン接種必要性診断技術の開発 （研究ニーズ） １）個人個人の感染感受性を測定して、 感染予防を行う必要性 ２）限られたワクチン生産の中で、ワクチン 接種の必要度の高いヒトからワクチン 接種することで、社会全体が守られる 感染者群と非感染者群の鼻汁中の抗インフルエンザ IgA抗体量の比較 A /Hiros ima/52/2005(H3N2) Infected n=43 Non-infected n=67 Infected n=40 Non-infected n=65 インフルエンザの 感染感受性は気 道粘膜の抗体価 で決まる。 感染者の鼻汁中の 抗体価は有意に低い （粘膜免疫の重要性） Anti‐Influenz a V irus s Ig A T iter [s pec ific s Ig A/total s Ig A(U/μg x 100)] 20 15 10 5 0 感染者 Infec ted Non‐infec ted 非感染者 Antiviral neuraminidase inhibitors attenuate local mucosal IgA responses, but not systemic serum IgG responses Anti-viral Sialidase Inhibitor Tamiflu Relenza Suppression of viral RNA replication and viral protein production Suppression of mucosal IgA production, but not serum IgG production Difference in antigen-dose requirement between mucosal and systemic immune responses % HA specific sIgA Fold increase 30 % HA specific sIgA Fold increase 30 1000 1000 % HA specific sIgA Fold increase 1000 30 %HA specific sIgA 30 P<0.05 25 100 100 20 10 10 1 5 post post/pre (N=6) No treatment 1 5 5 0 0.1 pre post (N=8) CAM 10 1 5 0.1 15 10 10 1 pre 10 15 10 100 20 20 15 10 0 25 25 100 15 1000 P<0.01 25 20 Fold increase post/pre 0 0.1 0 pre post (N=14) OSV post/pre 0.1 pre post post/pre (N=12) OSV+CAM （T. Sawabuchi, et al. Respirology、2009) 低病原性ウイルスのHA切断酵素は気道と腸管に、高病原性ウイルス のHA切断酵素は、全身に分布する： 低病原性 高病原性 Enteric duct Enteric duct/Endothelial cells/Airway Multiple organs (K. Kawaoka) 次世代のインフルエンザワクチンの戦略 世界の動き 皮下（筋肉内）注射 IgG 経鼻摂取 IgA/ IgG ・効果的で、・安全性の高い経鼻ワクチンの開発が望まれる 皮下（筋肉内）注射 １）肺炎防止（重症化予防） 血液IgG 経鼻摂取 ○ ○ ２）感染予防（感染しにくくする）鼻汁/気道IgA ━ ○ ３）周囲の人に感染させない ━ ○ 鼻汁/気道IgA Subcutaneous administration of vaccine induces serum IgG but not induces enough mucosal sIgA Antigen: Influenza A/Hiroshima(H3N2) A/New Caledonia(H1N1), B/Yamagata 鼻汁 A/広島(H3N2) specific IgA sIgA induction in nasal fluids (57case. mean±SD） 血清 A/広島(H3N2) specific IgG induction in serum IgG （57case) (N= 57) (High responder N=7) 8 60 前 後 μg/ml 40 20 pre post specific IgA/total IgA(%) 7 6 5 4 3 2 1 0 0 pre post ワクチン前 ワクチン後 ワクチン(A/California/7/2009 H1N1)接種前後の血清中のIgG 血清中IｇG (A/California/7/2009 H1N1) X≧1.2 血清中IgG (A/California/7/2009 H1N1) X≧1.2 n=213 50 (specific(U)/total IgG(ug))×100 30 20 30 20 10 10 pre 接種前 post 接種後 30 20 10 0 0 血清中IgG (A/California/7/2009 H1N1) X≦0.8 n=24 40 40 Anti-influenza Virus nIgG titer Anti-influenza Virus nIgG titer (specific(U)/total IgG(ug))×100 (specific(U)/total IgG(ug))×100 50 n=27 40 Anti-influenza Virus nIgG titer Anti-influenza Virus nIgG titer (specific(U)/total IgG(ug))×100 血清中IgG (A/California/7/2009 H1N1) 0.8<X<1.2 Anti-influenza Virus nIgG titer Anti-influenza Virus nIgG titer (specific(U)/total IgG(ug))×100 (specific(U)/total IgG(ug))×100 50 血清中IｇG (A/California/7/2009 H1N1) X≦0.8 血清中IｇG (A/California/7/2009 H1N1) 0.8<X<1.2 pre 接種前 post 接種後 0 pre 接種前 post 接種後 徳島市民病院・田岡グループ・東徳島病院・木下病院・兼松病院・佐藤病院 平均値＝13.0 2007/2008 シーズン ｎ=119 平均値＝14.2 ワクチン接種前 100.0 Anti‐Influenza Virus nIgA titer specific IgA (ug/ml) 90.0 ワクチン接種後 インフルエンザ患者鼻汁中ＩｇＡ A/California/7/2009 (H1N1) 2009/2010シーズン ｎ=230 80.0 70.0 60.0 50.0 平均値＝1.65 平均値＝1.58 40.0 ● ワクチン接種前 ● ワクチン接種後 平均値 30.0 20.0 10.0 0.0 ワクチン接種前 ワクチン接種後 開発目標と課題 １）鼻汁IgA、血清IgG中の抗インフルエンザ抗体価測定、大量処理可能なハイス ループットマイクロアレイ開発 ・カルボキシル化DLCチップを用いたマイクロアレイの基盤技術開発 （季節性インフルエンザ、新型インフルエンザのチップ搭載条件の確立） ・評価基準作成のための検体の収集 （倫理委員会の承認→検体収集組織の作成：目標値（鼻汁3,000検体、血 液3,000検体） ・集団検診に使用可能な鼻汁採取機材の開発、採取方法の確立 ・大量処理可能な要素技術の開発、基礎データの収集 ２）糖鎖修飾ウイルス蛋白質の大量発現系の開発 ・安全性に問題のある高病原性鳥インフルエンザの抗原蛋白質のリコンビ ナント蛋白質の発現系と精製系の確立 ３）小型自動測定装置開発のための要素技術の確立：反応の迅速化、洗浄 工程の効率化と短縮、スキャナーの高感度化、解析ソフトの開発 ELISAによる抗体価測定の問題点 １）大量処理が困難 ２）試薬量が多く、コストが高くなる ３）検査実施者の安全性確保が困難 ４）廃棄物が多くなり、廃棄コストと廃棄物の 安全性に問題がある。 ５）抗原量が多く、抗原確保に問題が生じる 次世代抗体価診断用ツール 低侵襲性 3 mm DLCカルボキシル化蛋白チップの基盤 （高密度抗原集積性） ＤＬＣチップ表面に2.5Å間隔で垂直に突き 出た反応基の高密度集積性が、高感度化、 幅広い定量性、微量検体を実現した。 カルボキシル化DLCの作成 抗原蛋白 NH2 （特色）カルボキシル化DLCの特性を生か した高感度化、高いS/N比、低い非特異的 吸着性に実現に成功 完成予想図 Total IgA/IgG Measurement IgA/IgG Standard Anti-Influenza IgA/IgG level (%): (IgA/IgG Binding unit/Total IgA/IgG)×100 ・Binding Unit ・血液、鼻汁の抗体価（ELISA) ・感染阻止効果（HI価）：中和活性測定 Virus Antigen Anti-IgA/IgG Ab チップ搭載抗原（１０年間の流行株） （A） １） H1N1 ・A/New Caledonia/20/99 ・A/California/7/2009 ・A/Brisbane/59/2007 ・A/Solomon Island/3/2006 H1N2 ・A/Yokohama/22/2002 ２） H2N2 ・A/Asia/1/57 ３） H3N2 ・A/Panama/2007/99 ・A/Uruguay/716/2007 ・A/Hiroshima/52/2005 ・A/New York/55/2004 ・A/Wyoming/3/2003 ・A/Panama/2007/99 ・A/Aichi/2/68 ４） H5N1 ・A/Vietnam/1203/04 ・A/Turkey/15/06 ・A/Hong Kong/156/97 （B） ・B/Shandong/7/97 ・B/Brisbane/60/2008 ・B/Florida/4/2006 ・B/Malaysia/2506/2004 ・B/Shanghai/361/2002 ・B/Shandong/7/97 ・B/Johannesburg/5/99 （合計２３株） 搭載予定：１1株 測定方法 DLC チップ チップの活性化 抗原の固定化 抗原蛋白質の 固定化 ブロッキング 抗原ー抗体反応 1~2 μL 患者血清 蛍光 標識２次抗体 蛍光検出 Fluorescence Intensitu (-Blank) Concentration of standard IgA （Unit/mL) マーカー IgA Standard (Unit/ml) 0.05 ＮＣ 0.125 広島 0.25 マレーシア 0.5 Ｂｒｉ 1.25 Ｕｒｕ 2.5 Ｆｌｏ 5 Ｃａｌ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ 患者 No.632 Standard Standard ： WHO human serum IgG 、A 、M (67/086) （将来の展望：機器開発） １）１人１アレイのカートリッジによる全自動測定システムの開発と ２）マルチ検体の全自動測定システムの開発 インフルエンザ感染リスク診断アレイ １）１人１アレイの開業医向けタイプ ２）検査会社向けのマルチ検体用システム開発 Protein Chip Analyzer Detecto r 蛋白チップ 様々な抗体検査へ応用 が可能となる 鼻汁 採血 Protein Chip Analyzer 感染リスク診断システム お問い合わせ先 徳島大学 疾患酵素学研究センター、 共同利用・共同研究「酵素学研究拠点」 教授 木戸 博 Tel: 088-633-7423 Fax: 088-633-7425 E-mail: [email protected]
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