リアルタイムPCR法による硝化細菌の検出

2014 年度
応用生物学部卒業論文概要
論文題目
リアルタイム PCR 法による硝化細菌の検出
氏名
指導教員
望月翔太
浦瀬太郎
キーワード：硝化細菌 , アンモニア酸化細菌 , 活性汚泥 , リアルタイム PCR,
Nitrosomonas europaea
1. はじめに
硝化細菌は生育速度が遅く、寒天培地ではコロニーを形成しないため数の定
量を迅速に行うことが困難である。そのため本研究では、リアルタイム PCR
法で DNA 量を測定し、水環境サンプルや排水処理汚泥に含まれる硝化菌の数あ
るいは活性を迅速に測定することを目指す。
2. 実験方法
本学の排水処理施設から活性汚泥を採取し、土壌 DNA 抽出キットを使用し DNA
を抽出した。抽出した DNA から硝化細菌由来の DNA をリアルタイム PCR 法で、
アンモニア酸化細菌(AOB)を標的のプライマー、CTO189f-RT1r を使用し測定し
た。また、活性汚泥中の硝化細菌の割合をだすために、16S rDNA の真正細菌
(EUB)を標的のプライマー、BACT1369f-PROK1492r を同サンプルに使用し測定
した。対照実験として純菌(Nitrosomonas europaea)と大腸菌でも同じプライマ
ーを使用し測定した。測定法はインターカレーション法、反応条件は
{95℃:30sec-[95℃:15sec-60℃:35sec]×40cycle}で、その後、融解曲線分析
を[95℃:15sec-60℃:30sec-95℃:15sec]で行った。
3. 結果・考察
純菌(Nitrosomonas europaea)では EUB プライマーと AOB プライマーで、ほぼ
同様の増幅曲線、Ct 値を得た。大腸菌では EUB プライマーでは増幅し、AOB
プライマーでは増幅しなかった(図 1)。また、活性汚泥では EUB プライマーと
AOB プライマーで増幅が確認でき（図 2）、その Ct 値の差からアンモニア酸化
細菌は活性汚泥中の約 7％を占めると考えられた。
図 1.大腸菌の増幅曲線
図 2.活性汚泥の増幅曲線

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