Genome-wide shRNAスクリーニング法によるエイズウイルス感染制御因子の探索東京医科歯科大学医歯学総合研究科ウイルス制御学分野武内 Interview report 寛明先生 ――エイズウイルス感染制御因子の探索に殖し、別の細胞に新たに感染伝播するまでに multiplicityof infection）の設定です。MOI genome-wide short hairpin RNA（shR- 一定の時間がかかります。レンチウイルスベクが大きすぎると、細胞傷害を引き起こすリス NA）スクリーニング法を導入した経緯を教えターを用いることで、それに内包（パッケージクが増大する可能性があります。最適なMOI てください。ング）されたshRNA発現カセットがゲノムには細胞の種類や実験の目的によって変わるの組み込まれ、標的遺伝子を安定的に抑制できで、各自で十分に検討する必要があります。武内先生（以下、敬称略）：ある病原体が引き起こす感染症の病因解析においては、病るのです。原体と宿主との攻防に注目し、どのような感染制御因子（宿主因子）が関わっているのかなお、本研究の場合、75のサブクローナル ―― MISSION shRNAライブラリーが最適な理由は何でしょうか。なHIV感染耐性細胞集団を得ることが出来、それらの細胞集団で遺伝子発現制御されていを明らかにする必要があります（図1）。その武内：10種類の独立したサブプールに分割る遺伝子群を同定する目的で、各々の細胞集ためには、HIV生活環に関わる宿主因子を網されて提供されているのが大きなメリットだと団から得られたshRNA配列を含んだPCR産羅的に探索する必要があります。そこで、宿思います。shRNAコード領域は、細胞に組物を、それぞれ50 ∼ 100個のプラスミド主因子の遺伝子発現を抑制するshRNAのラみ込まれやすいものもあれば、組み込まれに DNAにクローン化しました。大規模なスクリーイブラリーを使うことにしました（図2）。くいものもあります。このバイアスは、プールニングに見えますが、「これだけで済んだ」と型の欠点ですが、10種類のサブプールに分割いう印象です。siRNAを使うと導入量が予想はなく、レンチウイルスベクターのshRNAを ―― small interfering RNA（siRNA）でされているので、1つのプールで行うよりも、しにくいのですが、本手法では候補がかなり採用した理由は何でしょうか。バイアスのリスクを大幅に軽減出来る可能性絞り込まれます。武内：理由は3つあります。まず、遺伝子導入効率の高さについてですが、HIVの感染が高いと考えられます。これは網羅的解析において大きなアドバンテージの一つです。標的細胞であるTリンパ球やマクロファージといった浮遊細胞や非分裂細胞は、一般的には ――スクリーニングの結果どのように研究が発展していくのでしょうか。 ――スクリーニングを進めたときに一番困難だったこと、その突破方法を教えてください。武内：PCRとクローニングのバイアスです。どの機能遺伝子を標的としたshRNA配列を遺伝子導入効率が低いといわれています。し武内：スクリーニングの結果、HIVの生活含んだPCRクローンが何個出てきたかではなかしレンチウイルスベクターは、こういった細環をサポートする酵素が見いだされました。現く、そのshRNAが標的とする機能遺伝子の胞にも遺伝子導入できます。在、この酵素の阻害剤となるリード化合物を発現がHIV感染耐性細胞集団で実際に抑制さ見出しており、さらに改良して医薬品への開れたレベルで優先順位を決めるほうがよいで発につなげようとしているところです。しょう。高次構造をとる配列でも伸長しやす次に、遺伝子導入量の制限です。siRNAでは細胞への導入量を制限できず、最終的に目的とする宿主因子の特定に時間と労力がか ―― 新しくスクリーニングを始める先生方かってしまいます。その点、レンチウイルスベに、実験のコツについてのアドバイスをお願いクターは、ゲノムに組み込まれるshRNAコーします。ド領域は多くても数種類なので、その後の解析は比較的容易です。いPCRキットを検討するのも一つの手です。あるいは、次世代シーケンサーを使用できる場合には、その結果に基づいて優先順位を武内：まずは、研究対象として取り扱う細胞つけることも可能かもしれません。各自の実に対し、レンチウイルスベクターを用いた遺伝験環境に合わせた方法を考える必要がありま最後に、安定的に標的遺伝子を抑制できる子導入システムが適用できるかの条件検討を行す。ことも重要です。病原体は、感染してから増うことです。あわせて、感染多重度（MOI: 図1 HIVの複製様式図2 ヒトT細胞株ライブラリーの樹立およびHIV感染耐性細胞株の選択法 ①吸着・侵入 ⑤成熟ウイルス粒子の出芽・放出 shRNA レンチウイルスベクター shRNA- レンチウイルスライブラリーを HIV 感染感受性細胞である MT-4/CCR5 細胞 ( ヒト T 細胞 ) に 48 時間感染ウイルス RNA 及び蛋白質の集合ピューロマイシンで 2 週間選択培養 ②逆転写プレインテグレーション複合体核内移行 ④翻訳ウイルス蛋白質 shRNA 発現ヒトT 細胞 HIV NL4-3 株を 12 日間感染核外移行 HIV 感染耐性細胞限界希釈して 2 週間培養 ③組み込み転写ヒトT 細胞 HIV 感染耐性 T 細胞株（サブクローナルな集団） SAJ1955