„Next Generation Sequencing“ für die Primärdiagnostik Focus: Resistenztestung Stefan Niemann Molekulare Mykobakteriologie Forschungszentrum Borstel TTU-TB Deutsches Zentrum für Infektionsforschung Outline • Einleitung • Was ist „Next Generation Sequencing“? • Warum NGS für Resistenztestung? • Wie gut funktioniert das? • Ausblick Genom basierte Diagnostik • • • • • • • Spezies Identifizierung Resistenz Marker Virulenz Marker Genotypisierung Genomevolution Populationsstruktur Phylogenie Alle relevanten Informationen in einer Analyse Resistenzmechanismen • Genetische Variationen die zufällig entstehen und selektioniert werden • Im Genom fixiert und vererbbar/übertragbar • Mehr als 400 Varianten in mehr als 40 Genen • Komposition von Mutationen kann hoch komplex sein Niemann et al. 2003 “Next generation sequencing” Massiv parallele Generation Millionen kleiner Sequenzen: • Keine Klonierung der DNA in Vektoren • Generierung kurzer Sequenzen (bis zu 400bps) • Genom Sequenzierung von bis zu 200 Mtb Genome in 2 Tagen • Optimal für die Re-Sequenzierung klinischer Isolate • Kurze Sequenzen (Reads) werden an einer Referenzsequenz ausgerichtet Next Generation Sequenzierung Auslesen der Relevanten Information Daten Analyse MIRU-VNTR Rohdaten NGS A A A A Struktur RNA-Polymerase Funktion Quelle: Comas et al - Nat Genet. 2011 MolMyk – Pathogenomik Platform Nextera XT Probenvorbereitung 1 ng DNA, 96 Proben pro Tag 3,460 Bibliotheken erstellt 132 MiSeq, 6 HiSeq, 6 NextSeq runs MiSeq 2x301bp 47 mio Reads 3,400 Borstel TB Stämme 30 isolates per run, 15 Gbp 1,100 externe Proben 4,500 Stämme sequenziert HiSeq Rapid 2x150bp 530 mio Reads Meta Daten verfügbar 192 isolates per run, 80 Gbp Stämme/DNAs in Biobank NextSeq mid 2x150bp 260 mio reads 60 isolates per run, 35 Gbp Optimierter “Workflow” für die Laborintegration 50 to 100 € per sample MolMyk – Pathogenomik Platform Durchsatz: Kapazität pro Woche Warum NGS?: Genotyp – Phänotyp Korrelation Genotyp – Phänotyp Korrelation Mehr als 400 SNPs beschrieben TB PANNET PZA Resistenz Studie 1,950 Stämme, 1,142 MDR, 483 sensible Stämme 280 Mutationen: 67 Indels 213 SNPs Miotto P et al. mBio 2014; doi:10.1128/mBio.01819-14 TB PANNET PZA Resistenz Studie Miotto P et al. mBio 2014; doi:10.1128/mBio.01819-14 TB PANNET PZA Resistenz Studie Miotto P et al. mBio 2014; doi:10.1128/mBio.01819-14 NGS - Automatisierte Datenanalyse PhyResSE Online Tool Evaluierung in klinischen Isolaten Prospektive Evaluierung Verbesserung der Datenbank Feuerriegel et al. JCM in press NGS - Automatisierte Datenanalyse • • • • 96 Stämme analysiert 75 MDR, 21 INH oder RIF Resistent PhyResSE Sanger Sequenzierung von Resistenzgenen (katG, rpoB, pncA, embB) Alle durch Sanger Sequenzierung gefundene Mutationen durch NGS gefunden Stämme automatisch in phylogenetische Linien klassifiziert gene # SNPs sanger sequencing # SNPs WGS analysis katG 77 77 rpoB 88 88 pncA 72 72 embB 73 73 Feuerriegel et al. JCM in press NGS - Automatisierte Datenanalyse Ergebnisse DST - Sequenzierung PhyResSE gene mutation amino acid exchange DST result katG 944g>C Ser315Thr INH resistant rpoB 1333c>G His445Asp RIF resistant pncA 289g>T Gly97Cys PZA resistant embB 916a>G Met306Val EMB resistant Ergebnisse NGS basierend auf PhyResSE Zusätzliche Mutationen gefunden Feuerriegel et al. JCM in press Borstel NGS Diagnostik Workflow Krankenhaus Sequenzierung MTB NRZ Diagnostik Computing Zusammenfassung NGS bietet neue Möglichkeiten für Diagnostik/Molekulare Epidemiologie NGS basierte Genomanalyse eignet sich sehr gut für MTB Ausbruchsanalyse “Bench top sequencers” können in den normalen Labor Workflow integriert werden NGS basierte Genomanalyse wird wahrscheinlich in den nächsten Jahren zur Standardmethode für Epidemiologie und Diagnostik Aber: Genotyp - Phänotyp Korrelation ist schwierig Nachweis von heterogenen SNP Populationen schwierig Aufbau valider SNP Datenbanken (Enzyklopädie) essentiell Analyse klinischer Proben noch nicht möglich Thanks to Molekluare Mykobakteriologie Stefan Niemann Silke Feuerriegel Christiane Gerlach Susanne Homolka Thomas Kohl Sven Malm Judith Petersen Anja Lüdemann Matthias Merker Silvia Maaß Molekulare Mykobakteriologie Stefan Niemann Silke Feuerriegel Anna Engstrom Christiane Gerlach Susanne Homolka Barbara Tizzano Judith Petersen Thomas Kohl Sven Malm Glennah Kerubi Leila Jeljeli Ecaterina Noroc Patrick Beckert Matthias Merker Doreen Beyer Anja Lüdemann Silvia Maaß Tanja Ubben Julia Zallet Tanja Struwe-Sonnenschein Thanks to E. Sanchez Epicentre, Paris M. Bonnet MSF, Geneva S. Rüsch-Gerdes, E. Richter NRC Mycobacteria Borstel P. Supply Institute Pasteur Lille K. Fellenberg V. Schleusener Bioinformatik Borstel T. Wirth Muséum National d'Histoire Naturelle Paris R. Diel Institut für Epidemiologie Universität Kiel S. Gagneux Tuberculosis Research Unit Swiss TPHI Basel Global Beijing study group* *25 researchers supporting this study with 24 loci MIRU-VNTR and DST data D. Cirillo TB PANNET coordinator San Rafaele, Milan All other cooperation partners
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