様々な培養基材表面で均一な細胞凝集塊を大量に形成させるためのマスクシート東京大学先端科学技術研究センター教授生田幸士講師池内真志 1 胚様体の大量生産が必要幹細胞幹細胞の培養胚様体形成分化誘導 2 従来の胚様体培養手法ハンギングドロップ細胞非接着性培養基材細胞懸濁液をディッシュの天井に吊した状態細胞同士の凝集により，自発的に胚様体が形成 ○ 細胞サイズの制御が可能 ○ 大量生産が可能 ☓ 煩雑な操作が伴う ☓ 胚様体サイズが不均一大量・均質生産は困難 3 目的胚様体培養の初期条件１．播種数２．播種密度を、胚様体1個オーダーでコントロールする 4 本技術のマスクシート（複数条件用） 5mm 特徴１．テーパ—形状を有する多数の貫通孔２．表面：細胞超低接着性３．柔軟・自己接着性 5 本技術を用いた培養プロトコル例マスクシート細胞培養皿などポイント・任意の基材面に置くだけ – 接着剤不要 ①基材に貼付貫通孔・これ以降は、従来通りのプロトコルが適用可能幹細胞 ②細胞播種 ③胚様体形成胚様体 6 本技術のメリット① 従来手法 ①基材の選択不可本手法 ①基材の選択自由低接着シャーレ・温度応答性シャーレetc. ポリスチレン,ガラスetc. ゲル（コラーゲン等） ②細胞が残留・効率低下・再現性低下インサート ②残留なし高再現性・高効率 7 本技術のメリット② 培養皿 x [mm] y [mm] マスクシート細胞（懸濁液濃度 C [mm-3]） t [mm] ① 1ウェルあたりの細胞数 = C t x2 C:細胞濃度(/mm3)， t：溶液深さ(mm)，x：上部開口径(mm) ② ウェル内の細胞密度 = C t x2/ y2 y：下部開口径(mm) 1回の播種操作で、複数条件下で胚様体培養 8 応用① 胚様体形成の至適条件検討 6h [mm]160.0 140.0 クラスタ直径 120.0 24h 100.0 80.0 下部開口φ280 下部開口 φ280um φ280 um 下部開口φ240 下部開口 φ240um φ240 um 下部開口φ180 下部開口 φ180um φ180 um 下部開口φ140 下部開口 φ140um φ140 um 60.0 40.0 20.0 0.0 0.0E+00 1.0E+05 2.0E+05 3.0E+05 4.0E+05 5.0E+05 6.0E+05 上部開口面積 7.0E+05 [mm2] 168h １．胚様体サイズ。 2．至適な播種密度域が存在する。 200mm 9 応用②大量生産用マスクシート同一サイズ・形状の貫通孔を大量に配置．400個/cm2 10 iPS細胞の胚様体形成 Yukawa H. et al., Biomaterials 2011 従来手法（HD) Day0 Day1 Day2 Day3 Day4 Day0 Day1 Day2 Day3 Day4 本手法 11 胚様体大量生産の実証 Yukawa H. et al., Biomaterials 2011 胚様体形状の均一性回収個数長短径の差(μm) 1cm2あたりの回収個数本技術従来手法(HD)の10倍の生産効率 12 想定される用途・スクリーニングモデルとしてのがん細胞凝集塊の大量作製・幹細胞の均一な胚様体形成による分化誘導の効率化・電極基板との組み合せによる脳モデル，心筋モデルの培養・解析・生体に安全な基材であるので、例えば皮膚等に微粒子をパターニングすることもできる。 13 実用化に向けた課題 •現在、手作業で作製しているため、大量生産に適した製造手法を開発しなければならない。・表面を保護するため、現状、ウェットな状態での保管が必要である。実用化に向けて、乾燥状態で保存できる処理手法を開発中。・一部培養基材には接着が弱いため、接着面の素材を検討中。 14 企業への期待 •培養用の基材を取り扱っている企業は、本技術と既存の基材を組み合わせることで、 3次元培養製品が容易に開発できると思われる。 •乾燥状態で親水性を維持できる表面処理や、新水表面への接着技術を持つ企業との共同開発を期待。 •大量の細胞塊を必要とする用途にも有用。 15 本技術に関する知的財産権 •発明の名称：任意の分布形状と分布密度を有する分子または粒子の集団を同時に多種大量生成する方法とその方法に使用するマスク材 •登録番号：特許第5231909号 •出願人：科学技術振興機構 •発明者：生田幸士、池内真志 16 お問い合わせ先【ライセンスについて】科学技術振興機構知的財産戦略センター桑島健ＴＥＬ０３－５２１４－８４８６ e-mail [email protected] 【技術内容について】東京大学先端科学技術研究センター池内真志ＴＥＬ０３－５４５２－５１６２ e-mail [email protected] 17