VOL. 18. NO. CHEMOTHERAPY 4 429 核 酸 関 連 化 合 物 の 抗 腫 瘍 性 の 研 究(I) 6-Mercaptopurine-riboside (Thio-inosine)のRauscher Leukemia virus及 びLeukemia 1210 細 胞 に 対 す る 抑 制 効 果 藤 田 晴 久 ・豊 島 滋 慶応 大学医学部薬化学研 究所 ・2研 (昭 和44年12月22日 6-Mercaptopurine(以 下,6-MPと 略 す)の 抗白血病 ウ イル ス性 及 び抗 腫 瘍 性 に つ い て は 既 に 多 くの 報 告 の あ る と こ ろ で あ る が1),よ り毒 性 が 低 く 且 つ 効 果 の 適 確 な 抗 白血 病 性 化学 療 法 剤 の 検 索 が 望 まれ て い る 。 6-Mercaptopurine-riboside(以 は6-MPのribosideに 下,6-MPRと 相 応 し,今 略 す) 日 ま で,PIERCEら2), BROCKMAN3,5),JEANETTEら4),SIDWELL6,7)ら GOLDINら8)に の詳 細 な治 療 効 果 に つ い て の系 統 的 私 共 は 核 酸 関 連 化 合 物 の抗 腫 瘍性 の 検 索 研 究 の一 部 と leukemia 制 効 果 とLeukemia 1210細 胞(以 virusに 対 す る抑 下,L-1210と 略 す) 増 殖 に 対 す る 抑 制 効 果 に つ い て 検 討 を 行 な つ た の で,こ びSACHS9)の 適 当 な稀 釈 液 を生 後5週 令 の マ ウ スに 尾 静 脈 内 注 射 し,5∼7日 験 に は生 後4∼5週 またL-1210の virus(以 下,RLV)の 実 マ ウス を 使 用 した 。 実 験 に は体 重18∼20gのBDF1マ ウス を 使 用 した 。 使 用 ウイ ル ス 及 び 細 胞:今 回 使 用 した マ ウス 白血 病 ウ イル ス はRLVで L-1210は 酢 酸4.5:40%ホ 京 大 ウ イル ス研 の松 本 教 授 か ら,ま た ウ イル ス,L-1210細 胞 増 殖:106/mlのL-1210細 胞 及 び 薬 物 の 投 与:ウ 胞 の0.1ml を腹 腔 内 接 種 し,薬 物 投 与 は 細 胞 接 種24時 亡 す る まで1日1回 L-1210細 間 後 か ら死 投 与 した 。 胞 の 薬 物 耐 性 獲 得:L-1210細 のL-1210細 胞の薬物耐性 腹腔内に連続投 与 目に 行 な い,4代 イ ル ス, 測 定 し漸 次 投 与 量 を増 加 して い っ た 。 耐 性 形 成 係 数 は 所 定 の継 代 後 の 細 胞 に対 す る最 小 有 効 量 (mg/kg/day) /感 受 性 株 に 対 す る最 小有 効 量(mg/kg/day) で 現 わ した 。 推 計 学 的 処 理:得 られ た 実 験 結 果 の 有 意 性 の 算 定 に は,ま ず 得 ら れ た 結 果 をSMIRNOFFの 棄 却 法 に よ り整 理 した の ち,標 本 平 均,標 本 分 散,標 準 偏 差 を 求 めF分 布 に よ り5%及 危 険 率 に 於 け る有 意 差 を 検 討 び1%の した 。 実 験 結 果 sideの Ribo- 急性毒 性 ま ず6-MPと6-MPRの マ ウ ス腹 腔 内 投 与 に 於 け る 急 性 毒 性 を 観 察 し た 。6-MPのLD50は380mg/kg, た。 ウイ ル ス接 種 後 の脾 臓 重 量 の 測 定:ウ イ ル ス の腹 腔 内 ウ スを 頸 動 脈 切 断 で放 血 死 させ,開 腹 して 脾 臓 を別 出 し,そ の 重 量 を測 定 した 。 MPRのLD50は2.59/kgで 6-MPRは6-MPよ 6- あ つ た 。 これ か ら み る と り遙 か に 毒 性 が 低 く,約1/7の 毒 性であ るといえる。 また 脾臓 に於 け る ウイ ル ス 含 量 は,そ の 脾 臓 のhomoge- 2 : 使 用 し たRLVの nateを 調 整 し,こ れ を マ ウス に 接 種 し てFocus 使 用 したRLVを0.1ml/10gに For- 継 胞に対す る薬物の最小有効量 を 1 : 6-Mercaptopurineと6-Mercaptopurine 胞 及 び 薬 物 の投 与 は 腹 腔 内 投 与 に よ り行 な つ 接 種 後一 定 日数 を 経 た の ち,マ ル ム ア ル デ ヒ ド4.5 であ る 。 癌 研 究 所 の桜 井 博 士 か ら分 与 され た も の で 当 研 究 所 で 継代 維 持 され て い る も の で あ る 。 L-1210細 算定 す る。 固 定 液 の処 方 は70%エ タ ノー ル91:氷 補 正 して使 用 した 。 令 のICR-JCL系 方 法 に よつ た 。 即 ち 被 検homoge- 後 放 血 死 亡 さ せ,脾 臓 を別 出 し下 記 の 数 を算 え てFFUを 代 後 に,そ の も の を使 用 し,ま た6- Leukemia 測 定 はPLUZ- nateの も共 に アル カ リ溶 液 と して 加 温 に よ り 溶 解 し,次 い で 動 物:Rauscher 測 定:FFUの NIK及 森 下 製 薬 か ら提 供 を 受 け た 。6-MPも6-MPR HClでpHを8.2∼8.4に 測 定 す る こ とに よ り定 量 した 。 Unitの し,細 胞 継 代 は 細 胞 接 種 後5∼6日 実験 材 料 及 び 方 法 薬 剤:6-MPはMerck製 Forming 獲 得 に は 最 小 有 効 量 の 薬 物 を1日1回 れ の実 験 の結 果 につ い て 記 述 す る。 MPRは Unit (FFU)を Focus L-1210細 な検 討 は 殆 ん ど報 告 を み てい な い。 して,6-MPRのmurine ming 処 方 の 固定 液 に 加 え て形 成 さ れ た 病 変 発 現cell-colony 及 び よつ て そ の 抗 白 血 病 性 及 び 抗 腫 瘍 性 が 報 告 さ れ て い る が,そ 受 付) 力価の測定 腹 腔 内 接 種 し,28 430 CHEMOTHERAPY 表1 Rauscher Leukemiaウ イルスの力 価の 測定 JuLY 表3 初 期 投 与 に 於 け る6-mercaptopurineと6mercaptopurine-ribosideの Leukemiaウ 表2 Focus Forming Unitに 1970 抗Rauscher ィ ル ス 効 果 よ る力 価 の測 定 表4 初 期 投 与 に 於 け る6-mercaptopurine riboside の最小有効量 日後 に脾 重 量 を 測 定 し各 ウイ ル ス稀 釈 液 接 種 マ ウ ス の 中 で 有 意 の脾 重 量 の 増 加 を示 した マ ウ ス を 感 染 陽 性 と判 定 して,50%マ ウ ス感 染 量(MID してintact 0.02で mice 50)を 測 定 した 。 対 照 と 13匹 の脾 重 量 を 求 め る と0.159土 MPRの あ つ た 。 実 験 の結 果 は 表1に 示 す 。 また 同 一 の ウイ ル ス材 料 の 感染 価 をFFUの り検 討 した 。 そ の 結 果 を表2に Focusは ウイ ル ス接 種 後8日 重 複 し正 確 なFocus数 ウイ ル ス接 種 後7日 で 以 下FFUの 測定に よ 目に な る とあ る部 分 で は を 算 定 す る こ とが 不 確 実 と な る 。 目の 値 が 最 も脾 重 量 法 と0致 す る の 測 定 に 当 つ て は ウイ ル ス接 種 後7日 3:6-Mercaptapurineと6-Mercaptopurine 目に Ribo- 初 期 投 与 した 場 合 のRauschervirus抑 RLVは ウ イ ル ス 接 種 後 脾 臓 中 に3日 制効果 目位 か ら 現 わ れ 10∼14日 で最 大 量 に 対 し以 後 恒 久 的 に 維 持 され る の で 6-MPRを ウイ ル ス接 種 後 初 期 に投 与 した 場 合,中 投 与 した 場 合,更 0.1m1/10g腹 後,3日 期に に 後 期 に 投 与 した 場 合 に つ い て検 討 し た 。 ま ず 初 期 に投 与 し た 場 合,50 MID 50のRLVを 腔 内 接種 し,接 種 後30分,1日 後 及 び4日 後 の5回 に 亘 り1日1回 内 に 投 与 し ウイ ル ス接 種 後25日 後,2日 薬 物 を腹 腔 目に 脾 重 量 を 測 定 した 。 表3に 見 ら れ る と お り,6-MPRの び936魚9/k9/dayの て も認 め ら れ るの で,更 mg/kg/dayの 最 小 有 効 量 は312 腹 腔 内連 続 投 与 で あ る。 4:6-MercaptopurineRibosideを 合 のRauschervirus抑 中 期 投与 し た 場 制 効果 次 に ウイ ル ス接 種 後3日 目か ら5日 間6-MFRを 効 果 は312mg, いずれの投与量 に 於 い に最 小 有 効 量 の決 定 の た め6一 投与 した 場 合 のRLVに 対 す る 抑 制 効 果 に つ い て 検 討 した 。 実 験 の 結 果 を表5に 示す。 表5に 見 ら れ る とお り,6-MPRも6-MPも 共 にRLV に 対 し抑 制 的 効果 を 示 す が ウイ ル ス の 接 種 量 を100 MID50の 範 囲 に 留 め た 場 合 に 著 明 で あ り,且 つ連 続 投 与 で の 最 小 有 効 量 は6-MPで 6-MPRで は1回 量10Gmg/kg/day, は300rng/kg/dayで あ る。" 5:6-Mercaptopurine-Ribosideを 合 のRauschervirus抑 6-MPRの 後期投与 した 場 制効果 投 与 を ウイ ル ス 接 種 後16日 目か ら開 始 し投 与 期 間 を7日 間 と し,観 察 期 間 を150日 とす る後 期 投 与 実 験 を行 な つ た 。 また これ ま で の6-MPRに 実 験 の結 果 を 表3に 示 す 。 624m9及 を 表4に 示 す 。 以 上 の結 果 か ら み て,srの 示す。 判 定 を 行 な うこ と と した 。 sideを 投 与 量 を 小 量 に して行 な つ て み た 。 実 験 の 結 果 形 成 の抑 制 が6-MPRに よ る 巨大 脾 よ る ウイ ル ス増 殖 の抑 制 を第1 義 的 機 作 と して い る のか,あ るい は ウイ ル ス増 殖 に 起 因 す る組 織 の 病 変 現 象 の 抑 制 を主 要 作 用 部 位 とす る もの か voL. 18. No.4 CHEMOTHERAPY 表5 表6 中 期 投 与 に 於 け る6-mercaptopurineribosideの 後 期 投 与 に よ る6-mercaptopurxne を 明 らか にす るた め脾 内 ウイ ル ス量 をFFUに よ り測 定 した 。結 果 を表6に 示 す 。 表6に 示 す とお り,6-MPRも6-MPも 効果 ribosideと6-mereaptapurineの 6: L-1210細 効 果 胞 増 殖 に 対 す るC-Mercaptopurine, Mercaptopurine-Ribosideの 共 にRLVに よる巨 大脾 形 成 と脾 内 ウイ ル ス 量 に 対 し抑 制 効 果 を 示 し てい る。 こ の こ と は6-MPRと6-MPの 431 巨 大脾 形 成 の 6- 効 果 以 上 の 実 験 の 結 果6-MPRがMurine Leukemia ウ イ ル ス に 抑 制 的 効 果 を示 す こ とが 明 らか に され た の で次 に マ ウ スLeukemia 抑 制効 果 が脾 内 ウイ ル ス 増 殖 の 抑 制 に起 因 す る もの で あ MPRの る ことを 示 して い る 。 す。 1210細 胞 に 対 す る6-MPと6- 効 果 に つ い て 検 討 し た 。 実 験 の 結 果 を 表7に 表7か 量 は1日1回 ら 明 ら か な と お り,L-1210に 連 続 投 与 し た 場 合6-Mpで 示 対 す る最 小 有 効 は7.5mg/kgノ 432 CHEMOTHERAPY 表7L1210細 胞 増 殖 に 対 す る6-mercaptopurine と6-mercaptopurineribosideの JuLY 1970 を 投 与 す る。 この よ うに して 耐 性 発 現 の 時 間 経 過 を追 つ 効 果 て ゆ く と,図1に 図1に 示 す よ うに な る。 示 さ れ る と お り,6-MPRに 胞 の 耐 性 の 獲 得 は6-MPに 対 す るL-1210細 対 す る 耐 性 獲 得 よ り遅 く, し か も 形 成 さ れ た 耐 性 度 は6-MPRの ほ うが6-MPよ り低 い よ うで あ る 。 8:6-Mercaptopurine耐 ptopurine耐 性L-1210細 性L-1210細 胞 と6-Merca- 胞 に 於 け る交 叉 耐 性 前 節 で 記 述 し た と お り形 成 さ れ た6-MP耐 細 胞 と6-MPR耐 性L-1210細 性L-1210 胞 の間 に 於 け る 交 叉 耐 性 に つ い て 検 討 を 行 な つ た 。PIERCEら2)及 BROCKMANら3)及 6-MPに 開 裂 し,作 MPと6-MPRと 図1 薬 剤 耐 性L-1210 CellSの 形 成 の 時 間 経 過 び初期の びSKIPPERSら9)は6-MPRは 急速 に 用 す る も の で あ り,し た が つ て6- の 間 に は 完 全 な交 叉 抵 抗 が 成 立 す る と 報 告 し て い る 。 そ の 後BROCKMAN 5)は 細 胞 に 於 け るFormylglycinamide ribonucleotide合 を指標 耐 性Hep No.2 成 と し て,6-MPと6-MPRと6-Mercaptopurine ribonucleotideの 作 用 を 検 討 し て い る が,6-MPと6- Mercaptopurine ribonucleotideの が 成 立 す る が,6-MPと6-MPRの 間に完全な交叉耐性 間 に は こ の よ うな 充 分 な 交 叉 耐 性 は見 出 せ な か つ た と報 告 して い る。 この よ うに 交 叉 耐 性 の 問 題 は な お 充 分 解 明 され て い な い と 言 え るの で こ の点 に っ い て の 検 討 を行 な つ た 。実 験 の 結 果 を 表8に 示す。 表8に 見 ら れ る と お り,6-MP耐 6-MP及 day, 6-MPR で は18.5 mg/kg/dayで ある。 7: L-1210の6-Mercaptopurine及 purine-Riboside耐 び6-MPRは 6-MPR耐 び6-Mercapto- 性獲得の時間経 過 性L-1210細 と6-MPR に 対 す るL-1210の 過 を 検討 した 。 最 小 有 効 量 の6-MPま 耐 性 発 現 の時 間 経 た は6-MPRを 1日1回 連 続 投 与 し,投 与 され た マ ウス の 死 亡 前 にL- 1210細 胞 を 次 の 無 処 置 マ ウ スに 移 し,更 に これ に 薬 物 表8 6-mercaptopurine耐 性L-1210細 胞 と6-mercaptopurine 時 に も 共 に 抑 制 効 果 を 示 さ な い 。 即 ち こ の 点 に 於 い て,6-MP 性 細 胞 の間 に は 交 叉 耐 性 の 成 立 が 認 め られ る。 細 胞 の 出現 の 難 易 で あ る。 こ の 点 を 明 らか に す る た め 6-MP 胞には 胞 に 対 し て は6-MPRも6-MP 耐 性 細 胞 と6-MPR耐 抗 腫 瘍 性 薬物 の 評 価 に とっ て1つ の 問 題 点 は 薬 剤 耐 性 性L-1210細 共 に 抑 制 効 果 は 示 さ ず,同 考 察 及 び 6-MPと6-MPRのRauscher L-1210細 要 約 Leukemia virusと 胞 に 対 す る 効 果 に つ い て 検 討 し た 。6-MPRの マ ウ ス 腹 腔 内 投 与 に 於 け るLDsoは2.5g/kg,こ し て6-MPの そ れ は380mg/kgで riboside耐 性L-1210細 れに対 約1/7で 胞 に 於 け あ る。 る 交 叉 耐 性 VOL. 18. NO. Rauscher Leukemia を1日1回5日 CHEMOTHERAPY 4 virusに 対 す る6-MPRと6-MP らべ た 場 合,必 間 投 与 した 場 合 の 最 小 有 効 量 は6-MPR で300∼312mg/kg, 6-MPで100mg/kgで あった。 で で あ り,そ れ 以 上 の 接 種 ウイ ル ス量を 用 い た場 合 に は,6-MPRも6-MPも 効 果 は必 ず し も判 然 と しな い 。 こ のLD50と よ り治療 係 数 を 算 出 す る と,6-MPRで で ある の に 対 し,6-MPで イ ル スに 対 して もL-1210細 MPよ り大 で あ る 。 この こ とは6-MPRの 最小有効量 問 題 と も 関連 す るか も分 ら な い 。 これ ら の点 は 今 後 の 検 討 に よ り解 明 され る問 題 で あ ろ う。 文 巨大脾形成 の 1) 後 か ら投 与 して も,ウ イ ル ス 接 種16日 ら投 与 を始 め て も認 め られ る も の で あ つ た 。 この よ うな 6-MPで51で 4) そ れ は7.5mg/kgで あ るに対 し 5) り,且 耐 性 のL-1210細 り も い くぶ ん 遅 い よ う で あ 胞 は6-MPRに も 交叉耐性 た6-MPR耐 性L-1210細 胞 は6-MPに 耐 性 を 示 す 。 こ の こ と は 生 体 内 で6-MPRは さ れ て6-MPと に よ り6-MP R. W. ROBERT W. ROBERT ANTITUMOR Re- J. DIXON, & HOWARD 769•`772 ELI- THOMAS, E. SKIP- (1963) : Cancer Res. 25, 1596•`1605 GALEN & FRANK M. SCHABEL, W. Report 50, 299•`312 9) SIDWELL, 28, H. 1•`29 (1966) SELLERS, SCHABEL, HARRY : Cancer & L. 535•`546 SKIPPER, 425•`437 Cancer Jr. GA:Cancer B. WOOD, Jr. Chemotherapy & Re- (1968) 33(3), E. M. SARA Jr. (1968) PLUZNIK THOMSON M. GOLDIN, R. ENGLE 1, H. FRANK 35•`40 ABRAHAM D. & SARA J. DIXON, J. & F. M. SACHS : J. Nat. Cancer (1963) A. MONTOGOMERY, SCHABEL : Cancer J. R. Res. 19, (1959) イ 有効量 と く EFFECT HARUHISA Pharmaceutical 121•`128 JEANETTE, SIDWELL, J. DIXON Inst. か も そ のRauscherウ 対 す る 含 有 量 を6-MPの 199, SELLERS port 8) とを 示 唆 し て い る 。一し か しそ の 反 面,6-MPRは6-MP ル ス とL-1210に GLON H. BROCKMAN BROCKMAN Res. 7) も 脱 リボ ー ス なつ て作 用 す る もの で あ る こ に くら べ 著 し く毒 性 は 低 く,し OZOA: 14, (1962) DULMAGE, : Nature LEN な り こ れ がphosphoribosyltransferase ribosideと NATIVID Chemotherapy MONTOGOMERY, A. ROBERT を 示 し,ま 137•`138 A. Chemotherapy つ形 成 され た 耐 性 度 も低 い よ う で あ る 。 しか し 6-MPに 18, Cancer WALLACE M. 対 す る 耐 性 発 現 に 要 す る 日数 は ほ うが6-MPよ & (1965) 6) 6-MPRの HALL Report BROCKMAN JOHN R. あつ た 。 6-MPと6-MPRに W. ZABETH き これ か ら 算 出 し た 係 数 は6-MPRでB5で R. PER 最 小 有 効 量 は18.5mg/ 献 JUDITH Chemotherapy port 3) 革 の抑制 に 起 因 して い る も の と考 え ら れ る。6-MPと 6-MPRはL-1210細 胞 接 種 後 の 平 均 生 存 日数 を延 長 す あ り,こ れ に対 し6-MPの PIERCE, (1961) 後か 巨 大 脾 形 成 の 抑 制 は ウ イ ル ス の増 MILA Cancer 2) kgで 総 て が6-MP に 転 換 され な い こ とに 起 因 して い る と も考 え られ る し, は380/100=3.8で6-MPR る。 この点 に 於 け る6-MPRの 胞 に 対 し て も6- 生 体 内で そ の よ うな 転 換 の部 位 に 到 達 し滲 入 す る 効 率 の 抑 制 効果 は ウイ ル ス 接 種 直 後 に これ ら の 化 合 物 を 投 与 し 6-MPと6-MPRの 治療 係 数 はRaus- cherウ 共にその は2500/300=8,3 が 約2倍 大 で あ つ た 。6-MPと6-MPRの て も,3日 ず し も毒 性 の低 下 ほ どに は 効 果 の低 下 は 来 して い な い 。 換 言 す れ ば,6-MPRの この有 効量 で充 分 な抑 制 を 得 るた め の 接 種 ウイ ル ス 量 の 限 界は100MID50ま 433 OF NUCLEIC FUJITA Institute, and School ACID ANALOGUES (I) SHIGESHI TOYOSHIMA of Medicine, Keio University The inhibitory activity of 6-mercaptopurine and 6-mercaptopurine riboside against Rauscher Leukemia Virus and Leukemia 1210 cells was studied. LD50 of 6-mercaptopurine riboside was 2.5g/kg in mice by intraperitoneal injection and that of 6-mercaptopurine was 380 mg/kg. 6-Mercaptopurine and 6-mercaptopurine-riboside were effective against Rauscher Leukemia Virus. The therapeutic index of 6-mercaptopurine-riboside was 8.3 and that of 6-mercaptopurine was 3. 8. These drugs were effective against Leukemia L-1210 cells too, and the therapeutic index of 6-mercaptopurineriboside was 135, and that of 6-mercaptopurine was 51. From these results, it may be said that 6mercaptopurine riboside was effective twice than 6-mercaptopurine. The development of the resistance of L-1210 cells to 6-mercaptopurine riboside wasslower and a little weaker than that of 6-mercaptopurine resistance. The clear cross-resistance between 6-mercaptopurine resistant cells and 6-mercaptopurine-riboside resistant ones, was observed.
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