発生工学（2014） Ⅲ．全胚培養 1．全胚培養とは着床後の哺乳類胚を体外培養することを「全胚培養」という。 1-1．全胚培養の歴史 1934～1938 Nicholas and Rudnic ラット胚をラット血漿とラット抽出液を含む培養液で培養し、2～16 体節期まで成長した。 1938 Jolly and Lieure 1963-1964 ラットおよびモルモット胚の培養では培養温度（37～39℃）が重要であると報告。 New and Stein マウスとラット胚を、鶏胚抽出液を添加した培養液で、静置培養の時計皿法（Watch glass culture）で、凝固血漿を用いて培養した。培養胚の 72％に血液循環系が形成され、30％が胚芽形成期まで発育した。 1967 New ガラス製の筒状培養管に胎子を固定し培養液を気相ごと貫流する培養法（Circulator system）を考案。この手法により、ラットおよびマウス胚の器官形成期（ラット 9～11 日、マウス 7～10 日）を 96 時間まで培養できた。しかし、準備に時間と手間を要すること、一度の実験で培養できる胎子の数が少ないこと、培養液の消耗が激しく、汚染する確率が高いことなどから医薬品の代替試験法としては使用されなかった。 1970 New ローラーボトル法（Roller bottle/tube system）を考案。気相を数時間ごとにボトルに注入する必要があり、長時間の器官形成期の培養には不向き。 1974 New 自動送気型回転培養装置（Rotator system）を開発。 1978 に改良型が発表され広く利用されている。 2．全胚培養の方法 2-1．使用できる発生段階全胚培養を開始できる発生段階は、器官形成初期（中胚葉形成が開始する時期、ラットは妊娠 8 日胚、マウスは 6 日胚）から器官形成後期（四肢の指が形成される時期、ラットは 13 日胚、マウスは 11 日胚）の間に限られる。ラット 9 日胚では 4～5 日間の培養が可能だが、ラットでは 11.5 日、マウスでは 9.5 日以降の胚の発育は、胎盤機能に依存するところが大きいため、培養可能期間が短くなる。図培養可能なラット胚およびマウス胚の発生段階と培養期間（脳科学辞典 Web より） - 13 - 発生工学（2014） 2-2．培養条件全胚培養に用いられる培養液は、有効成分・必要成分が詳しく調べられておらず、細胞培養用の培地が適しているという保証がない。そのため、100％血清が用いられるが、溶血している血清では培養成績が下がるため、市販のものではなく、IC 血清（immediately centrifuged serum）を各自で採取、調製する。理想的には同種血清が望ましいが、手間とコストの面からラット血清が便宜的に使用されている。気相は、胚の発生段階によって酸素濃度を変える必要があり、5％CO2 を除く部分は窒素で調整する。培養条件の一例実験動物＝ラット胎齢 11 日目，12 日目培養時間：48 時間，72 時間解剖手技：New の子宮壁切開法， Cock loft の卵黄嚢開放法， Yokoyama の血管止血法培養装置：自動送気式回転培養装置回転数：20 回／分培養温度：38℃ 培養液：ラット血清 100％培養液量：5ml 培養瓶用量：25ml 培養気相：5％CO295％02 混合ガス培養気相流量：100ml／min 薬液処理法：培養液内添加薬液量：100μ1 添加物：グルコース，ストレプトマイシン＋ペニシリン混合キット 500μ1 観察項目：（生理機能）胎児心拍動数（分化機能）胎児総体節数（成長の指標）胎児頂殿長、胎児総体重、総蛋白質量、頭部長【出典】横山（2006）日薬理誌 128：303 3．全胚培養の応用現在、全胚培養が可能となっているのはラットとマウスだけであり、それも、器官形成期の初期に限られている。また、材料となる胎子は、生体から採取しているし、培養には 100％血清を用いている。したがって、安全性試験における代替システムとして利用するには、まだ不十分であるが、使用する動物個体の数を大幅に減少させたという面では評価されている。応用の例 ① 細胞系譜や分化様式の研究 ② 発生毒性、胎子代謝、催奇形性など医薬品の安全性試験 ③ 遺伝子導入や遺伝子発現制御技術を利用した基礎研究 ④ 疾患モデル動物に対する遺伝子治療の研究 Ⅳ．雌雄の産み分け ※追加資料はありません。テキスト 7 章を参照してください。 - 14 -