Kobe University Repository : Kernel Title ラパマイシン標的タンパクmTORを介した細胞内情報伝 達系の研究 (研究) Author(s) 米澤, 一仁 Citation 神戸大学医学部神緑会学術誌, 18: 93-96 Issue date 2002-08 Resource Type Departmental Bulletin Paper / 紀要論文 Resource Version publisher URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/81007749 Create Date: 2015-02-01 神緑 会学 術 誌 第18巻2002年 研究 ラ バ マ イ シ ン標 的 タ ンパ クmTORを 介 した 細胞 内情報伝達系 の研 究 神 戸 大 学 バ イ オ シ グ ナ ル研 究 セ ン ター 1イ て,蛋 子elF-4Eに 下,P70と ンス リ ン の 下 流 に あ っ 略 す)(図1)と 略 す)(図2)が 仁(56年 卒) 訳 の 開始 にか か わ の1種 バ マ イ シ ン は,マ で あ る が,生 ク ロ ラ イ ド系 の 抗 生 物 質 体 に 投 与 す る と,T細 胞 の増 殖 を 抑 制 し,免 疫 抑 制 効 果 を 発 揮 す る こ と が 知 ら れ て い 翻訳開始因 る.こ の 免 疫 抑 制 剤 で あ る ラバ マ イ シ ンで 細 胞 を 処 理 し て か ら イ ン ス リ ン 刺 激 を す る と,P70は 結 合 す る 蛋 白 質eIF4E-bin(h㎎protein1 (以 下,4E-BP1と さ て,ラ 白質の 合成 が促 進 され る こ 白合 成 を司 る シ グ ナ ル伝 達 分 子 と してp70S6 キ ナ ー ゼ(以 一 る シ グ ナ ル伝 達 分 子 で あ る1). と免 疫 抑 制 剤 ラ バ マ イ シ ン と は 以 前 よ り知 られ て い た.イ 澤 Eと 解 離 す る こ と に よ り,mRNA翻 ン ス リ ン に よ る蛋 白 合 成 促 進 作 用 イ ンス リ ン に よ っ て,蛋 米 化 を 受 け,活 あ る.P70は, 脱 リ ン酸 性 化 さ れ な く な り,4E-BP1も,脱 リ イ ンス リ ン刺 激 を う け る と,複 数 の 部 位 に リ ン酸 化 を ン酸 化 を受 け,eIF-4Eと 結 合 し,翻 訳 の 開 始 を抑 制 う け 活 性 化 さ れ,リ す る1>.こ の よ う に,ラ バ マ イ シ ンが翻 訳 に関 連 す る 在 す るS6蛋 ボ ゾ ー ム40Sサ ブ ユ ニ ッ トに 存 白 を リ ン酸 化 す る セ リ ン ・ス レ オ ニ ン蛋 シ グ ナ ル伝 達 因 子 群 を 脱 リ ン酸 化 し,翻 訳 を抑 制 す る 白 質 リ ン 酸 化 酵 素 で あ る(1).一 方,4E-BP1は,翻 こ とが 明 ら か と な っ た が,そ 訳 開 始 因 子elF-4Eと は 謎 の ま まで あ っ た. 激 を う け る と,複 結 合 し て い る が,イ ン ス リ ン刺 数 の 部 位 に リ ン 酸 化 を 受 け,eIF4 図1p70S6キ ナ ー ゼ(p70α1)の 一93一 構 造 と リ ン酸 化 部 位 の詳細 な分子 メカニ ズム 皿 ラ バ マ イ シ ン 標 的 蛋 白 質mTORの 酸 化 に お い て も 観 察 さ れ た.即 ち,4E-BP1は,ア ノ酸 の 除 去 に よ り脱 リ ン酸 化 を う け,ア 発 見 ラ バ マ イ シ ン は 細 胞 膜 を 透 過 す る と,FK506結 蛋 白 質12(以 下,FKBP12と 合 体 を 形 成 す る.こ 略 す)と 合 に よ り リ ン酸 化 を う け る4). 結 合 し て,複 の ラ バ マ イ シ ン ーFKBP12複 こ の ア ミ ノ 酸 に よ るp70の 合 活 性 化 そ し て4E。BP1 の リ ン酸 化 は ラ バ マ イ シ ン の 添 加 に よ り抑 制 され る. 体 の 細 胞 内 標 的 蛋 白 質 が探 索 さ れ,mammaliantarget こ の 実 験 結 果 よ り間 接 的 で は あ る が,ア ofrapamycin(mTOR)(図3)が 70あ る い は4E-BP1へ は 分 子 量 約290kDaの lipidkinaseに 同 定 され たU.mTOR 巨 大 蛋 白 質 で,そ 似 たkinasedomainを のC末 端 に は,Heat repeatと 呼 ば れ る構 造,㎞asedomainを よ びFATCdomain,そ す ぐN末 して ㎞asedomainの 端 側 に は ラ バ マ イ シ ン ーFKBP12複 結 合 す るFRBdomainが FKBP12複 存 在 す る.ラ 合 体 がFRBdomainに さ て,ア 合体が 結 合 す る とmTOR た して い る の で あ ろ う か.こ ら ア ミ ノ 酸 を1種 解 析 が 試 み ら れ た.そ キ ナ ー ゼ 活 性 化 が 抑 制 され る こ とが 知 られ て い る.最 て い て も,p70活 近,我 ら,分 蛋 白 が,p70と4E-BP1の あ り,こ 上 流 に存 在 す る 分 子 で れ ら翻 訳 に 関 連 す る シ グ ナ ル 伝 達 因 子 群 の リ れ は,活 性 化 に用 い た 類 ず つ取 り除 い た溶 液 を 準 備 し,細 胞 を 処 理 し,p70の 活 性 を測 定 す る事 で の 結 果,分 シ ン を取 り除 い た 時 に,た 々 も含 め た 複 数 の グ ル ー プ に よ り,こ のmTOR の ア ミ ノ酸 グ ナ ル 伝 達 系 の 活 性 化 に 重 要 な役 割 を果 DMEMか バマイ シン ー の シ グ ナ ル 伝 達 の 間 にmTOR ミ ノ酸 は20種 類 存 在 す る が,ど がmTORシ 挟 む よ うに ミ ノ酸 か らp が 存 在 して い る こ と が 示 され た5,. もつ セ リ ン ・ス レ オ ニ ン蛋 白 質 リ ン酸 化 酵 素 で あ る.N末 FATお 端に ミ ミ ノ酸 の 添 加 岐 鎖 ア ミノ 酸 の ロ イ と え 他 の ア ミ ノ酸 が 含 まれ 性 が 劇 的 に低 下 す る と い う こ と か 岐鎖 ア ミノ酸 の ロ イ シ ンの重 要 性 が 明 らか と な っ た5).し か し な が ら,HEK293やCHO細 ロ イ シ ン を 単 独 で 加 え て も,p70の ン酸 化 の 制 御 に か か わ っ て い る こ とが 明 ら か に な っ て れ な い.た き た2,3》. を 用 い る と,ロ だ し,ラ 胞 では 活 性 化 は観 察 さ ッ ト肝 癌 細 胞 で あ るH411E細 イ シ ン の 単 独 添 加 で もp70の 胞 活性 化 が 観 察 で きる5). 皿mTORシ この 系 を 用 い る 事 に よ っ て,ロ グ ナ ル 伝 達 系 と ア ミ ノ 酸, 特 に 分 岐 鎖 ア ミ ノ酸 ロ イ シ ン と の 関 連 mTORを よ び4E-BP1と 同 じ よ う に イ ンス リ ン な どの 細 胞 増 殖 因 子 か ら の シ グ ナ ル で あ ろ うか?そ え は,意 の答 外 な 事 に細 胞 培 養 液 中 の ア ミ ノ酸 成 分 で あ っ た4).細 胞 培 養 液 に は,通 常,ア ミ ノ酸 成 分 ・グ ル コ ー ス ・ビ タ ミ ン類 な どが 含 ま れ て い る.Hek293細 CHO細 部 分 が 大 切 で あ る か の 検 討 が 可 能 と な っ た.ロ 活 性 化 す る上 流 の シ グナ ル は何 で あ ろ う か?p70お 胞 を 使 っ て,血 清 非 存 在 下 に,通 養 液 をphosphatebufferedsaline(PBS)に 分 でp70の 活 性 は ほ ぼ0に イシン に は 市 販 で 様 々 な 誘 導 体 が 存 在 して お り,そ れ ら を用 い てp70の 活 性 化 を 検 討 した.そ シ ンの 側 鎖 構 造 は 必 要,b)ロ 要,c)ロ の 結 果,a)ロ イ イ シ ン の ア ミ ノ基 が 必 イ シ ンの 光 学 異 性 性(L体)が 重 要,d) ロ イ シ ンの カ ル ポ キ シ ル 基 は 重 要 な 要 素 で は な い と い う事 が 判 明 した5). 常の細胞培 Nア 変 更 し て30 ま で 低 下 す る.こ Dulbecco'sModifiedEagleMe(hum(DMEM)に こに 含 まれ る ア ミ ノ酸 と同 等 の ア ミ ノ酸 を 加 え る と,p70活 30分 で ほ ぼ 元 の 活 性 まで 回復 す る.こ 胞や 変 更 し,P 70活 性 の 時 間 経 過 を 観 察 す る と,PBSに イ シ ンの 構 造 の ど の 性は ミ ノ 酸 一mTORシ グ ナ ル 伝 達 系 と イ ン ス リ ン シ グ ナ ル伝 達 系 との ク ロ ス トー ク ま ず,p70がmTORキ ナー ゼ の 基 質 に な る可 能性 を検 討 した.FLAG-taggedp70cDNAをHEK293細 の 現 象 は,グ ル 胞 にtransfectionし,細 コ ー ス ・ビ タ ミ ン類 の再 添 加 で は 観 察 され な い.こ の 理 す る こ と に よ り,脱 リ ン酸 化 さ れ たP70を ア ミ ノ酸 に よ る 同 様 の 活 性 化 現 象 は,4E-BP1の リン 一94一 胞 回収 前 にラバ マ イシ ンで処 こ れ を 基 質 に 用 い た.mTORキ 調 整 し, ナ ー ゼ を特 異 的 モ ノ 神 緑会 学術 誌 ク ロ ナ ー ル抗 体 で,か つFLAG-taggedp70を 抗 体 で 別 々 の 細 胞 よ り同 じ プ ロ テ イ ンGセ ス ビ ー ズ 上 に免 疫 沈 降 し,p70の 抗FLAG ミノ 酸 濃 度 依 存 性 にp70の フ ァロ ー が わ か る.こ リ ン 酸 化 をazpお よ び 部 位 特 異 的 リ ン 酸 化 抗 体 で モ ニ タ ー し た.こ 果,p70は 第18巻2002年 の結 活 性 が上 昇 してい くこ と れ に イ ンス リ ン を添 加 す る と,各 酸 濃 度 で のp70の 活 性 は,さ ら に 上 昇 し,グ 全 体 と し て 左 方 に 移 動 す る.こ こにお い て 重要 な点 ナ ー ゼ に よ りリ ン 胞 外 液 中 に ア ミ ノ酸 が 全 く存 在 しな い 状 況 下 で キ ナ ー ゼ エ ク ス テ ン シ ョ ン と呼 は,イ ン ス リ ン を加 え て もp70の 酸 化 さ れ た.P70の 活 性 の上 昇 は 全 く ば れ る 部 位 に存 在 す る412番 の ス レオ ニ ン は,112vivo 観 察 さ れ な い と い う こ と で あ る.つ でP70活 い て は ア ミ ノ 酸 一mTORか 性 と密 接 に連 動 す る こ とが 報 告 さ れ て い p70の ス レ オ ニ ン412の リ ン酸 化 が 時 間 依 存 性 に増 加 す る こ と が 明 ら か と な っ た.同 リ ン酸 化 が,p70活 時 に こ のmTORに よ 性 の 上 昇 を時 間依 存 性 イ ッ チ に な う て い る と い う こ と で あ る.言 来 よ り,p70の お 我 々 は こ の 予 想 を見 事 に 加vitroで リ ン 酸 化 ・活 性 化 に は イ い換 え れ ば,ア ミ ノ1酸mTORか ら の シ グ ナ ル イ ン プ ッ トが, "pr㎞ ㎏ シ グ ナ ル"に な っ て い る とい う事 が で き るa) に 惹 起 す る こ と も明 ら か と な っ た6). さ て,従 ま り,P70に らの シ グナ ル イ ンプ ッ ト が 細 胞 増 殖 因 子 の イ ン プ ッ ト を受 け 入 れ る た め の ス ナ ー ゼ と の イ ン キ ュベ ー シ ョ ン に よ り, るp70の ラフは は,細 時 間 依 存 性 にmTORキ る.mTORキ ア ミノ 成 功 し た.即 ち,不 再現 す る こ とに 活 性 化 さ れ たp70をmTORそ し ンス リ ン等 の 細 胞 増 殖 因 子 か らの シ グ ナ ル が 最 も重 要 てPDx1とsequentialに 視 さ れ て い た 、 特 に細 胞 増 殖 因 子 受 容 体 に カ ップ リ ン 70活 性 を100倍 以 上 上 昇 させ る こ と に 成 功 した.こ グ す る ホ ス フ ァチ ジ ル イ ノ シ トー ル3一 活 性 上 昇 は,細 胞 を10%胎 下,PI3一 キ ナ ー ゼ と略 す)に 流 の 蛋 白 質 キ ナ ー ゼ で あ る3一 キ ナ ー ゼ(以 よっ て活性 化 され る下 免 疫 沈 降 したp70活 ホス フ ォイノ シ タイ ド も の で,加vivoで 依 存 性 蛋 白 キ ナ ー ゼ1(PKD1)に よ るp70の キ ナー 活 性 調 節 に重 要 で あ る こ とが 明 らか と 性 と同等 度 あ る い は それ 以 上 の の 活 性 化 を112vitroで ミノ ーmTORキ ナ ー ゼ か らの シ グ 以 上 の 結 果 を ま と め る と 図5の 経 路 が 考 え られ る.即 よ う な シ グ ナ ル伝 達 ち,細 胞 外 液 の ア ミ ノ酸 バ ラ ン ス レ オ ニ ン412番 を リ れ たPDKlがp70の キ ナ ー ゼ ドメ イ ン の 触 媒 ル ー プ ナ ル イ ン プ ッ トが 必 要 不 可 欠 で あ る こ と を 見 い だ し に あ るス レオ ニ ン252番 を リ ン酸 化 しp70を た.図4に と導 く とい う考 え 方 で あ る. 示 す よ う に横 軸 に ア ミ ノ 酸 濃 度,縦 70活 性 を と り,ア 再 現 で きた ン酸 化 す る と同 時 に,細 胞 増 殖 因 子 に よ っ て 活 性 化 さ しか しな が ら,我 々 は こ の 細 胞 増 殖 因 子 に よ るp70 の 活 性 化 に,ア 児 牛 血 清 で 刺 激 した 後 に, ス を 感 知 したmTORが,p70の な っ て い たi>. の と い え る6,7) ゼ ドメ イ ンの 触 媒 ル ー プ上 の ス レ オ ニ ン252の リ ン 酸 化 が,p?0の リ ン酸 化 す る こ と に よ りp 軸 にp 4E-BPユ ミ ノ 酸 濃 度 依 存 曲 線 を 描 く と,ア にお い て は,加vitroお 活性 化 へ よ び112VIVpで5 つ の リ ン酸 化 部 位 が 知 ら れ て お り,そ の う ち ス レ オ ニ ン37番 とス レ オ ニ ン46番 がmTORに よって リ ン酸化 され る とい わ れ て い る8.こ の リ ン 酸 化 が,い わ ゆ る "prhni㎎ シ グ ナ ル"に な っ て 他 の 酵 素 に よ る残 りの3つ ン65番,ス の部 位 セ リ レ オ ニ ン70番,セ リン 83番 の リ ン酸 化 を 誘 導 す る と考 え られ て い るが,イ ンス リ ン な どの 細 胞 増殖 因子系 の シグナ ル との関 連 は い まだ に 議 論 の あ る と こ ろ で あ る. 図4p70S6キ ナ ー ゼ 活 性 の ア ミ ノ酸 濃 度 依 存 性 曲 線 と そ れ に 対 す る イ ン ス リンの効果 VmTOR免 疫 沈降物 に 含 まれ るキナ ーゼ活性 通 常,一 般 的 な キ ナ ー ゼ は,あ 繊 維 芽 細 胞 を ア ミ ノ 酸 を添 加 し たPBS(○:ア ミ ノ 酸),あ る い は ア ミ ノ酸 添 加PBSに10一 アMイ ン ス リ ン を 加 え た も の(■:ア ミ ノ酸 十 イ ン る 特 定 の モ チ ー フ を リ ン酸 化 す る ス リン)で 処 理 後,p70S6キ こ とで そ の 基 質 特 異 性 が 決 定 さ れ ナ ー ゼ 活 性 を測 定 した. 一95一 References 1)Avruch,J.,Belham,C., Weng,Q.-P.,Hara,K.,and Yonezawa,K.(2001).Thep 細胞膜 70S6kinaseintegrates nutrientandgrowthsignalsto controltranslationalcapacity. InProgressinMolecularand SubcellularBiology,R.E. Rhoadsed(Berlin Heiderberg),pp.115-154. 2)Brown,E.J.,Beal,P.A., Keith,C.T.,Chen,J.,Shj皿,T. B.,andSchreiber,S.L. 図5ア ミ ノ 酸 一mTORの シ グ ナ ル 伝 達 系 と細 胞 増 殖 因 子 の シ グ ナ ル 伝 達 系 の ク ロ ス トー ク *はmTORに 結 合 す る未 知 の 因 子 を示 す (1995).Controlofp70s6 kinasebykinaseactivityof FRAPinvivo.Nature377, て い る.し か し な が らmTORキ ナ ー ゼ の 場 合,そ 免 疫 沈 降 物 を 用 い た 実 験 で は,p70に Thr-Tyrと お い て はPhe- い う 疎 水 性 の モ チ ー フ を,4E-BP1に て はSer/Thr-Proと い っ た い わ ゆ るProが チ ー フ を 主 と し て リ ン 酸 化 す る.1つ ま れ る こ の2つ え て,mTOR免 441-446. 3)Hara,K.,Yonezawa,K.,Kozlowski,M.T.,Sugimoto, お い T.,Andrabi,K.,Weng,Q.Y.,Kasuga,M.,Nishimoto, 後 に 続 くモ 1.,andAvruch,J.(1997)。RegulationofeIF-4EBPl の キナ ーゼが こ れ ほ ど 違 う モ チ ー フ を リ ン 酸 化 す る と い う の は,非 に 珍 し い 例 で あ る.加 の 常 疫 沈 降物 に含 の リ ン 酸 化 活 性 はCHAPSやNP-4と phosphorylationbymTOR.JBiolChem272,2645726463. 4)Hara,K.,Yonezawa,K.,Weng,Q.P.,Kozlowski,M. T.,Belham,C.,andAvruch,J.(1998).Aminoacid い っ た 界 面 活 性 剤 に 対 す る感 受 性 が 大 き く異 な っ て い sufficiencyandmTORregulatep70S6kinaseand る.即 elF-4EBPlthroughacommoneffectormechanism. ち,p70のPhe-Thr-Tyrと い う疎水性 のモ チー フ を リ ン 酸 化 す る 活 性 は,界 抗 性 で あ る が,4E-BP1に 面 活 性 剤 処 理 に対 して 抵 お け るSer/Thr-Proモ フ の リ ン 酸 化 活 性 は,mTOR免 剤 処 理 に よ り,完 結 果 よ り,我 全 に 消 失 し て し ま う.こ 々 は,mTOR免 チ ー 疫 沈 降 物 の 界 面 活 性 れ らの 実 験 疫 沈 降 物 中 に 界 面 活 性 剤 に 感 受 性 を 持 ち,4E-BP1のSer/Thr-Proモ チ ー フ の リ ン 酸 化 に 深 く 関 与 す る 分 子 の 存 在 を 考 え,現 在探 索 中 で あ る. JBiolChem273,14484-14494. 5)Shigemitsu,K.,Tsujishita,Y.,Miyake,H.,Hidayat, S.,Tanaka,N.,Hara,K.,andYonezawa,K.(1999). Structuralrequirementofleucineforactivationofp 70S6kinase.FEBSLett447,303-306. 6)Isotani,S.,Hara,K.,Tokunaga,C.,Inoue,H., Amch,J.,andYonezawa,K.(1999).Irnmunopurified mammaliantargetofrapamycinphosphorylatesand activatesp70S6kinasealphainvitro.JBiolChem w結 語 274,34493-34498. 以 上 の よ う な研 究 結 果 か ら,ア ア ミ ノ 酸 の ロ イ シ ン がmTORキ そ の 下 流 のP70・4E-BP1と ミ ノ酸,特 に 分1岐鎖 ナ ー ゼ を 活 性 化 し, K.,Tokunaga,C.,Shirai,Y.,Saito,N.,Gout,1.,and い った 翻 訳 関 連 シ グ ナ ル 伝 達 分 子 群 を リ ン 酸 化 ・活 性 化 し,蛋 白 合 成 に繋 が っ て 行 く と い う シ グ ナ ル伝 達 機 構 が 考 え ら れ る. mTORキ 7)Minami,T.,Hara,K.,Oshiro,N.,tleoku,S.,Yoshino, Yonezawa,K.(2001).Distinctregulatorumechanism forp70S6kinasebfromthatforp70S6kinasea. GenesCells6,1003-1015. ナ ー ゼ を 中 心 と した こ の 分 野 の 研 究 は,細 8)Gingras,A.-C.,Gygi,S.P.,Raught,B.,Polakiewicz, 胞 成 長 と い っ た 視 点 か ら も興 味 を も た れ つ つ あ り,生 R.D.,Abraham,R.T.,Hoekstra,M.F.,Aebersold,R., 物 一 般 の シ グ ナ ル 伝 達 系 と して 非 常 に 重 要 と考 え ら andSonenberg,N.(1999).Regulationof4E-BPl れ,今 phosphorylation:anobeltwo-stepmechanism. 後 の 発 展 が 期 待 され て い る. GenesDev13,1422-1437. 一96一
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