　Kobe University Repository : Kernel Title 単球、好中球の分化特異抗原MRP8/MRP14複合蛋白の動態と機能の検討 (助成研究報告) Author(s) 村尾, 真一 / 松本, 聖也 / 中西, 護 / 西村, 一孝 Citation 神戸大学医学部神緑会学術誌, 10: 167-170 Issue date 1994-06 Resource Type Departmental Bulletin Paper / 紀要論文 Resource Version publisher URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/81007357 Create Date: 2015-02-01 神緑会学術誌第 1 0巻 1 9 9 4年助成研究報告一一単球，好中球の分化特異抗原 MRP8/MRP14 複合蛋白の動態と機能の検討真尾西村松山赤十字病院病理村中西愛媛大学医学部病理学第一一 (50年卒) 松本聖也護孝国立療養所愛媛病院内科 1.はじめに原として単離・同定した分子量 8kDaと14kDa 最近 S1 0 0蛋白と高い相向性を有する分子種の 2種類の蛋白 ( M i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r - の c-DNA遺伝子が，細胞増殖や分化との関連 14 R e l a t e dP r o t e i n-8とMRP-14，以下 MRP8/ から次々に報告されている. MRP8. MRP14. 複複合蛋白と略す)の医学・生物学的特性を調 c a l c y c l i n . c a l p a c t i n-1 l i g h tc h a i n.p r o f i l l a g . べている。2)3)この蛋白は 1987年. Odinkらに r i n .c a l v a s c u l i n等などと呼ばれるものであるよって最初に，慢性関節リューマチの病変部の 1) マクロファージから産生される二種類の未知のこれらに共通するのは EF・ handと呼ばれ i +結合部位を分子内に 2箇所持つことで，るc 因子として，完全なかたちの c.DNA遺伝子が 2 Ca +との結合は蛋白としての疎水性結合力が得られた.遺伝子から予想されるアミノ酸配列高まると考えられており. Ca2+の関与した細を検討したところ，それまで多くの研究者から胞内シグナル伝達の点からも関心が持たれていいろいろな名称、，例えば白血球抗原(Ll る(表1).我々は好中球・単球の分化特異抗 a n t i g e n ) .c y s t i cf i b r os i sa n t i g e n，カルグラニュ表 1 S100m自ファミリー名前 1) (別称) 発現分化・増殖機能・局在細胞骨格 S100a/ S100b グリア細胞，その他 C a l p a c t i nl l i g h tc h a i n ( p 1 1，42C ) 小腸，腎，肺 + p3 6のリン酸化制御 C a l v a s c u l i n ( 18A 2，p9ka，42A) 血管平滑筋，その他 + ミクロフィラメントの集合 in ( C a l t y c¥ A9) 2 線維芽細胞 + 細胞周期 ( 01期) P r o f i la g g ri n 表皮細胞 + MRP8 /MRP-14 (CFa n t i g e n，c a l g r a n u l i n ) 骨髄細胞. マクロファージ + + ニューロンの伸張ケラチンの凝集炎症病変︽ u h EA 噌 η ，，リン A.Bなどと報告されていたものが.全くるいは THP-1単球性白血病細胞を 5nMPMA 同ーの蛋白か，あるいはその一部分であること存在下で 4日間培養した際の MRP8， MRP14 がわかってきた遺伝子の発現を N o r t h e r n法で検討したもので 4)5) 従って，呼び名については現在でも多少の混乱はあるが，一部を除いある .HL6 0細胞では時間の経過とともに漸増て MRP8 ・MRP14の名称を使うのが一般的でするが， THP-1細胞では 2日目にピークを迎ある . この蛋白は分子量 8kDaと1 4kDaのペプ 6 0細胞にえたあと減少していく. 一方， HL- チドがヘテロダイマーを構成し，末梢血単球・ PMAを加えた場合は MRP8，MRP14の発現の好中球に特異的に存在する.末梢血以外では網誘導は見られない. このような細胞や分化誘導内系細胞，特に肺・肝・牌の組織マクロファー剤による発現の違いをさらに免疫沈降法で検討ジに弱い発現がみられる. しかし，この蛋白のした ( 図2 ) . HL6 0細胞を 100nMの活性型ビ生物学的役割は炎症病変への関与が推定されるタミン D3 、で 3日間処理した後，ほかほとんど何も知られていない.我々はヒト加え 4時間後に細胞と培養液中に存在する前骨髄性白血病 ( HL6 0)細胞の分化・増殖の MRP8/14複合蛋白を NM-6抗体と共にプロテ 5nMPMAを調節の研究を進める過程において，ヒト骨髄球イン Aカラムから回収した .MRP8/1 4複合蛋系細胞(主に末梢血単球)に反応するマウス単白は前もって 35S メチオニンでラベルされて 1 4複合蛋クローン抗体のひとつとして MRP8/ いる.培養上清中に MRP8/ 1 4複合蛋白が出現白を認識する抗体 ( NM-6抗体)を得た. するのは活性型ビタミン D3 にさらに NM-6抗体は成熟分化をとげた単球・好中球加えた場合のみである(Ja n e8).また，細胞 PMAをと特異的に反応する性質のみならず， HL6 0細内の MRP8/14複合蛋白も PMA添加でやや増胞中では活性型ビタミン D3 処理で、分化誘導さ n e3と l a n e4). 加しているようにみえる(Ja れた細胞にも発現が見られる.以下では我々がこのよう、 PMAは HL6 0細胞で直接は MRP 解析しえた幾つかの MRP8/ 1 4複合蛋白の特徴 8， MRP14遺伝子の発現を誘導しないが，発的な性質について述べる . 現された後にそれらを調節する作用が示唆される.これは末梢血単球や好中球における MRP 2. HL-60 細胞における MRP8/ 14複合蛋白の発現と放出の調節 8/14複合蛋白の合成や放出が種々の炎症刺激で調整されている可能詩を考えさせる. HL-60細胞は各種分化誘導物質の存在下で好中球(1.3%ジメチルスルフォキシド， 1mM 伽 ' HL 6 0 THP 偏レチノイン酸など)，単球 ( 100nM活性型ピタ D a y s o0. 511 . 52 ミン D 3 )，マクロファージ (2nMp h o r b o l1 2 D a y s 4 0 0. 5 唱 1 . 52 4 m y r i s t a t e1 3 a c e t a t e;以下 PMAと略す)様細胞へと成熟・分化を遂げる .MRP8/ 1 4複合蛋 MRP8 白はこれらの中で好中球や単球様細胞に変化することで，処理後 2 4時間を過ぎると細胞内に出 ~I ，・現し，徐々に増えてくる . MRP8と MRP14遺伝子はそれぞれ独立して染色体の 1q上に存在揃 RP14 品晶畠鋪. . するが，その発現は非常によく同調している . 28 S rRNA 合成された蛋白は MRP8，MRP14単独で、はなく，それぞれ 1 1， 1 2，または 2 2といった割合の複合体を形成している.図 1は HL-60細胞を 1 0 0nM の活性型ピタミン D3 で，あ -1 6 8 図 MRP8，MRP1 4 遺伝子の発現を H L 6 0前骨 -1単球性白血病細髄性白血病細胞及び THP r t her nb lo ti n g法による検討胞の No 神緑会学術誌第1 0 巻 1 9 9 4年にあった .一方，入院患者の血清濃度を測定し 30- たところ，その範囲は 5 0 6， O O O n g /m1に及び，権患した原疾患や全身状態により値は広い範囲・- 1 4- 1 2 1". 25( OH) 2 D3 .ー PMA . 令 • 4 5 6 7 8 + + 守 + + + φ ー + Lーー一ーーーーーーーーー一向ーJ Medt a 3 」ー一一ーーーー~ C e l l s に分布した(図 3). これらの中で 8 0 0 n g / m l以上の高値を示した疾患は肺結核，慢性関節リウ ← MRP14 ← MRP 8 マチ，肺癌，肺サルコイドーシス，間質性肺炎，心房中隔欠損症，心不全などがあげられる.その一方，健常者と同じ範囲内には C型肝炎，再生不良性貧血，骨関節疾患が含まれていた.一般に，好中球増多症を伴っている場合には MRP8/14 複合蛋自の培養上澄中への放出. l a n e 8はビタミン D3 で分化した H L 6 0細胞に PMAを 4時間加えた.繕養液中に MRP 8 / 1 4 複合蛋白の放出がみられる. MRP8/ 1 4複合蛋白の血清値が高い .これは好 3 . MRP8/MRP14複合蛋白の血中濃肺疾患の多くで高値を示したことは注目され図2 中球に含まれる MRP8/ 1 4複合蛋白が血中へ放出されると考えられるが，好中球増多症を伴わない症例でも端息，肺結核，間質性肺炎などのる.これは肺胞マクロフ度の測定 7 ージを含む網内系細 9 5名の健康人血清を対照として 5 5例の入院患胞で MRP8/ 1 4複合蛋白の産生や放出が充進し者血清の MRP8/MRPI4複合蛋白濃度の測定をている可能性が考えられる.また，悪性腫傷 ( 肺 TwoA n t i b o d yS a n d w i c h法で行った癌を含む)でも高値を示す例が多く，この点に 6) MRP 8/14複合蛋白の精製は末梢血からマウス・モついては今後の検討を要する. ノクローナル抗体 (NM-6) をセフアロースに架橋したアフイニティーカラムを用いた 2) さらに， C4逆層カラムで MRP8 と MRP14に正常および各種疾患における血清 MRP-8/MRP-14 値 000 100，それぞれ単離したものを，ラピットに 3回以上免疫し，抗血清を得た.アッセイはまず，抗 MRP8抗体を 9 6-welELISAプレートの底に固着後，精製された抗原 (MRP8/ 1 4複合蛋白) または希釈された血清を 2時間インキュベートピチオン化抗マウ E 、 cl Z 1， 000 アルカリフォスフォターゼを加え，基質 100 ( PMPP) を発色させ， 690nmでの吸光度を測定した.精製抗原を用いた標準曲線では 1 ρ= ス 1gGl抗体で 2時間処理した後，アピヂン・ .・・.・“・・4F・hL th.fυ 叫曜日官、し， NM-6抗体に 2時間， 10， 000 n g /mlよりlO O ng/m lの濃度でほぼ直線的に，その他の疾怠心疾患慈性腫蕩{肺痴を除︿) 階に希釈し，標準曲線の再面性の高い範囲で測肝炎・肝硬変であった.血清は 1/9， 1/ 3 0， 1/ 2 7 0の 3段肺疾患して， 0. 3 ng / m l以上の濃度の抗原が測定可能肺癌上でプラトーに達した.また検出できる限界とコントロール 10 0 0 ng /ml以ついでなだらかなカーブを描き， 4 定した. 9 5例の健健常者の平均値は 1 8 6 n g / m l で 90%以上が4 0 n g / m lから 3 8 5 n g / m lの範囲内複合蛋自の血清中濃度. 図 3 症例別 MRP8/14 - 169- 4 . おわりに文献本稿では好中球・単球の分化特異抗原として 1) K l i g m a n， D .，•and Hii t， D . C .， Trends 1 4複合蛋白について我々の単離された MRP8/ ， . i 13，437-443，1 9 8 8 . B i o c h e m .S c 知見を中心に HL-60細胞での発現や血中濃度 .，C o l l a r t，F . R .，andHuberman，E， J . 2) Murao，S について述べた. MRP8/14複合蛋白はアミノ酸配列が S1 0 0蛋白と高い同一性を示すことよ B i o. lC hem.264，8356-8360，1989. .，C o l l a r t，F .R . ， andHuberman，E . 3) Murao，S 2 ，り Ca+の関与じた細胞内シグナル伝達や直接標的となる分子の検索に研究者の注目が集まっている C e l lGrowthD i f f e r .1，447-454，1990. ，S .，Nak 叩a n i s 油h 叫 i i ，M . Ma 抗t sumo 4) Murao c a l v a s c u l i n，c a l p a c t i n 1l i g h t ，丸N .，andHub巴rman，E .A L a b o r a t o r y Ued a 1 0 0蛋白ファミ c h a i n，S100sなど多くの S- . E .AcademicP r e s s H a n d b o o k .E d it .C e l i s，J リーに属するものは細胞骨格との聞に親和性を 1 l lp r e s s . 有することや，蛋白リン酸化や細胞骨格の構築の調節にあずかっているとの報告がある . A .，Edgeworth，， . ] andHogg， N.] . 5) H e s s i a n，P L e u k o .B i ol .53，197・204，1 993. 1) MRP8/ 1 4複合蛋白につれてはこれまでの炎症反応や細胞分化の特異抗原として解析されできたが， Ca2+の関与という見地から新たな検討が加えられる時期に来ていると言える. -170一