アデノウイルス作製受託サービス アデノ随伴ウイルス (AAV) 作製受託サービス Signa より、 gen 社独 に ム テ ス 自の Ad.MAX シ システムと AAV・HT パッケージング お客様 ！ のニーズ 現します 実 に沿ったリコ を 製 作 ンビナントアデノウイルス及び AAV TM TM アデノウイルス作製受託サービス 独自の Ad.MAXTM システムでアデノウイルス産生を最大化します！ 記事 ID 検索 13604 SignaGen Laboratories メーカー略号：SGL 概要 SignaGen 社が開発した Ad.MAXTM システムは遺伝 子改変したアデノウイルスパッケージング細胞 (Ad.MAXTM 293 細胞 ) とウイルスゲノム中のトラ ンス・エレメントから構成されています。この画 期的なシステムは目的遺伝子の発現を保証し、ア デノウイルス産生の最大化と適切な遺伝子導入を 可能にします。 図 1. Ad. MAX システムと従来法の比較 Ad.MAXTM システムとは？ Ad.MAX™ システムは遺伝子改変したウイルスパッケージング細胞 HEK293 とアデノウイルス産生を最大化するためのア デノウイルスシャトルベクター、またはアデノウイルゲノムにより構成されています。この技術のコアは改変された HEK293 細胞において、ウイルスタンパク質発現カセットは強く抑制される一方、アデノウイルスの複製能はそのまま維 持されていることです。HEK293 細胞の抑制カセットを認識するアデノウイルスゲノムのトランス・エレメントとの組み 合わせにより、Ad.MAX™ システムは最小限のタンパク質発現でアデノウイルス産生を最大化します。 本システムではアデノウイルスのパッケージング時に HEK293 細胞に細胞死を引き起こすような毒性遺伝子をもつアデノ ウイルスベクターのパッケージングに非常に有効です。 アデノウイルス作製受託サービス つづき アデノウイルス作製受託サービス サービス 受託に必要なもの 納期 Large Scale NCBI accession #、遺伝子シンボル Medium Scale 又は 4-5 週間 ** 目的遺伝子を組み込んだプラスミド DNA 納品物＊ 用途 高純度・高タイター アデノウイルスストック (>5 x 1010 ∼ 5 x 1011 PFU/ ml, 2 ml) in vivo 研究 (animal injection) 高タイターアデノウイルスストック (>2 x 1010 ∼ 2 x 1011 PFU/ml, 2 ml) 高タイターアデノウイルスストック (>2 x 1010 ∼ 2 x 1011 PFU/ml, 1 ml) Pilot Scale in vitro 研究 分裂・非分裂哺乳類 細胞への遺伝子導入 ＊アデノウイルス産生量は導入遺伝子の性質に依存します。 ＊＊目的遺伝子を SignaGen 社にて合成する場合、納期は都度確認となります。 作業内容 1. アデノウイルスベクターに目的遺伝子をクローニング 4. 2 x 塩化セシウム超遠心によりアデノウイルス精製 (Large Scale のみ ) 2. アデノウイルスストックを作製 3. Ad. MAX™ 293 細胞 (Large Scale の場合：約 4,000 cm2、 Medium Scale の場合：約 1,000 cm2、Pilot Scale の場合：約 500 cm2) を使用してアデノウイルスを増幅 5. リコンビナントアデノウイルスの PFU 測定 shRNA アデノウイルス作製受託サービス サービス Large Scale 受託に必要なもの 納期 標的遺伝子情報 (NCBI accession # or 配列情報 ) Medium Scale 又は 4-5 週間 検証済み shRNA 配列 Pilot Scale 納品物＊ 用途 高純度・高タイター アデノウイルスストック (>2 x 1010 ∼ 5 x 1011 PFU/ ml, 2 ml) in vivo 研究 (animal injection) 高タイターアデノウイルスストック (>2 x 1010 ∼ 2 x 1011 PFU/ml, 2 ml) 高タイターアデノウイルスストック (>2 x 1010 ∼ 2 x 1011 PFU/ml, 1 ml) in vitro 研究 分裂・非分裂哺乳類 細胞への遺伝子導入 ＊アデノウイルス産生量は導入遺伝子の性質に依存します。 お客様で標的遺伝子に対する shRNA 配列の情報が無い場合は、SignaGen 社にて無償で shRNA をデザインいたします。通常 80％以上 のノックダウン効率が得られますが、保証するものではありませんので、予めご了承ください。 ノックダウン効率の検証も含めた shRNA のデザインをご希望の場合は、shRNA バリデーション受託サービスをご利用ください。 詳細は弊社 Web サイトをご覧ください。 作業内容 1. アデノウイルスベクターに目的遺伝子をクローニング 2. アデノウイルスストックを作製 3. Ad. MAX™ 293 細胞 (Large Scale の場合：約 4,000 cm2、 Medium Scale の場合：約 1,000 cm2、Pilot Scale の場合： 約 500 cm2) を使用してアデノウイルスを増幅 4. 2 回の塩化セシウム超遠心によりアデノウイルス精製 (Large scale のみ ) 5. リコンビナントアデノウイルスの PFU 測定 その他、アデノウイルス作製受託サービス ・アデノウイルス増幅受託サービス ・shRNA アデノウイルス増幅受託サービス ・shRNA バリデーション受託サービス 記事 ID 検索 13604 アデノウイルス随伴ウイルス (AAV) 作製受託サービス 独自の技術で超高感染性・超高タイターの rAAV を作製します！ 記事 ID 検索 13604 13605 SignaGen Laboratories メーカー略号：SGL 概要 アデノ随伴ウイルス (AAV) は直径約 20 nm の複製欠 損・非エンベロープウイルスであり、ヒトや霊長目の 動物に感染しますが病原性は知られておらず、非常に 弱い免疫反応しか引き起こしません。AAV は分裂 / 非 分裂細胞の両方に感染可能であり、宿主のゲノムに組 み込まれることで長期の発現維持にも利用可能です。 アデノウイルスとは異なりリコンビナントアデノ随伴 ウ イ ル ス の 大 量 調 製 は 通 常 の 手 法 で は 困 難 で す。 SignaGen 社は独自の技術で非常に高い感染性の rAAV 粒 子 ( 通 常 の rAAV の 約 30 倍 の 感 染 性 ) を 超 高 タ イ ター (1 x 10 GC) で調製可能な下記の受託サービスを 15 図 2. 超感染性・超高タイター rAAV 調製のための SignaGen 社の アプローチ ・AAV・HTTM パッケージング細胞 : HEK293 細胞から独自に開発した本細胞は 通常の HEK293 に比べて 10 倍以上の rAAV 粒子を産生します。 ・改変 rAAV cis ベクター：オプションで導入遺伝子の下流に切断型 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) カ セ ッ トが組み込まれている rAAV cis ベクターをご選択頂けます。WPRE が組み 込まれることにより、8 倍以上の rAAV 粒子が産生されます。様々なプロモー ターとレポーターをご選択頂けます。 ご用意しております。 特長 ● 分裂 / 非分裂細胞及び初代培養細胞を含む広範な細胞 種で効率的な遺伝子導入が可能 ● 選 択 可 能 な セ ロ タ イ プ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 ● 宿主ゲノムの 19 番染色体へ目的遺伝子を導入 ● プロモーター及びレポーターの様々なカスタマイズが 可能 プロモーター：CMV, CAG (CBA), U6, H1, UBC, Synapsin プロモーター レポーター：GFP, mRFP, Luc, LacZ 等 図 4. 競合メーカー V、C 由来の rAAV ベクターとの純度と 感染性の比較 SignaGen 社の rAAV ベクターの超純度と超高感染性が確認された。 A: rAAV ベクター (total 1 x 109 VG/lane) を SDS-PAGE にかけ、銀染色を 行った。 Lane 1: CHOP 由来 rAAV ベクター (GMP 基準 ) Lane 2: SignaGen 社の 2 x 塩化セシウム超遠心 により調製した rAAV Lane 3: BCM の Vector Core 由来 rAAV Lane 4: 競合メーカー V 由来 rAAV Lane 5: 競合メーカー C 由来 rAAV Lane 6: 分子量マーカー B: rAAV9-GFP (total 5 x 109 VG) をマウス眼球に注入 左図：競合メーカー V 由来の rAAV9-GFP (total 5 x 109 VG) 右図：SignaGen 社の 2 x 塩化セシウム超遠心 により調製した rAAV-9-GFP (total 5 x 109 VG) 図 3. SignaGen 社 rAAV cis ベクター遺伝子発現カセット 図 5. 競合メーカー V 由来の rAAV ベクターとの感染性比較 A: 競合メーカー V 由来の rAAV1-GFP B: SignaGen 社の 2 x 塩化セシウム超遠心 により調製した pre-made rAAVs それぞれの rAAV1-GFP (total 2 x 109 VG) をマウス筋組織に注入し、GFP 蛍光 を 3 週間後に観察した。SignaGen 社の 2 x 塩化セシウム超遠心 により調製し た高純度 rAAV の超高感染性を確認した。 C: 精製法の違いによる純度の比較 GFP の 定 量 デ ー タ か ら SignaGen 社 の 高 純 度 rAAV (bar 2) は、通 常 の 塩化セシウム超遠心 により調製されたもの (bar 1) に対し約 9 倍の感染性を示 した。 アデノ随伴ウイルス (AAV) 作製受託サービス つづき rAAV 作製受託サービス サービス 受託に必要なもの 納品物＊ 納期 1.0 ml 以上の高純度 in vivo グレード rAAV ベクター (1 x 1013 VG/ml 以上 ) Large Scale NCBI accession #、遺伝子シンボル Medium Scale 2.0 ml 以上の高純度 in vivo グレード rAAV ベクター (1 x 1012 VG/ml 以上 ) 3-4 週間 ** 又は 目的遺伝子を組み込んだプラスミド DNA 1.0 ml 以上の高純度 in vivo グレード rAAV ベクター (1 x 1012 VG/ml 以上 ) Pilot Scale ＊最終的な産生量は導入遺伝子の性質に依存します。 ＊＊目的遺伝子を SignaGen 社にて合成する場合、納期は都度確認となります。 作業内容 1. 標的遺伝子 ( 最大 4.8 kb) を AAV cis ベクターにクローニング 2. pAAV cis プラスミドの大量調製 (Large 及び Medium Scale のみ ) 3. AAV・HTTM 293 細胞へのトランスフェクション (Large の場合： 2 x cell stack、Medium の場合：1 x cell stack、Pilot の場合： 10 x 150 mm plates) 4. 高純度の rAAV ベクターを得るために 2 x 塩化セシウム超遠心を 行い rAAV を回収 5. 脱塩、フィルター滅菌及び qPCR による AAV タイトレーション その他、アデノウイルス作製受託サービス ・rAAV パッケージング受託サービス 記事 ID 検索 ・shRNA/miRNA rAAV 作製受託サービス 13605 SignaGen Laboratories メーカー略号：SGL ・shRNA/miRNA rAAV パッケージング受託サービス ・shRNA/miRNA バリデーション受託サービス コスモ・バイオの受託サービスは、Web サイトに より詳細な情報を掲載しています。 お見積りやお問い合わせもこちらから行えます！ http://www.cosmobio.co.jp/ 詳細情報へは、記事 ID 検索コードを使うと便利です。 1 コスモ・バイオのホームページへ 記事 ID 検索 このアイコンの数字を入力 0000 3 お目当ての「記事 ID」を入力し、 検索をクリック！ まとめて検索 商品検索 カテゴリ検索 品番検索 SDS 検索 メーカー情報 検索 記事 ID 検索 0000 2 トップページの 「記事 ID 検索」を クリック！ ● 使 用 範 囲 ･･･ 記載の商品は全て、「研究用」です。 人や動物の医療用・臨床診断用・食品用等としては使用しないよう、十分ご注意ください。 技術サービス部 2014. 5 (12127)
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