遺伝子発現調節 試薬カタログ

GE Healthcare Dharmacon
遺伝子発現調節
試薬カタログ
shRNA 発現レンチウイルスベクター
● cDNA/ORF クローンコレクション
●
※これまでご 愛用いただいておりました Lentiviral RNAi
や遺伝子過剰発現などの「Open Biosystems」製品は
「Dharmacon(ダーマコン)」にブランド名を変更するこ
ととなりました。今後ともご愛顧のほどよろしくお願い申
し上げます。
取扱店
www.gelifesciences.co.jp
shRNA発現レンチウイルスベクター 製品選択ガイド
shRNA とは、RNA 干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型の RNA 配列です。shRNA はベクターによって細
胞に導入され、恒常的あるいは誘導的に発現します。通常このベクターは娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングの効果も受
け継がれます。shRNA のヘアピン構造は細胞内で siRNA へと切断され、RNA 誘導サイレンシング複合体(RISC )と結合します。こ
の複合体は siRNA と相補的な配列を持つ mRNA に結合し、切断します。
下表を参考にして研究目的に合った shRNA 発現レンチウイルスベクターをご選択ください。
発 現 レンチ ウ イルスベクター
shRNA
生物種
SMARTvector
Leniviral shRNA
SMARTvector Inducible
Leniviral shRNA
GIPZ
Lentiviral shRNA
TRIPZ Inducible
Lentiviral shRNA
ヒト・マウス・ラット
ヒト・マウス・ラット
ヒト・マウス
ヒト
microRNAベース*1
shRNAの種類
TRC
Lentiviral shRNA
ヒト・マウス
シンプルヘアピン型
プロモーター
7種類から選択
4種類から選択
ヒトcytomegalovirus
プロモーター
Tetracycline誘導性
蛍光マーカー
TurboGFP/TurboRFP/無し
TurboGFP/TurboRFP
TurboGFP
TurboRFP
ー
ー
●
ー
●
ー
高力価ウイルス粒子*2
高力価ウイルス粒子*2
大腸菌グリセロールストック*3
高力価ウイルス粒子*2
shRNA発現の誘導性
製品フォーマット
*4
shRNA Starter Kit
掲載ページ
P3
P4
プロモーター
大腸菌グリセロールストック*3
shRNA Starter Kit*4
P5
ヒトU6プロモーター
大腸菌グリセロールストック*3
P6
P7
*1 microRNA ベースの shRNA は、Drosha/Dicer によるプロセシングを正確に受けるため特異的な遺伝子発現抑制が可能です。また、シンプルヘアピン型の shRNA に比
。
べて細胞毒性が低いことが示唆されています(McBride et al. , Beer et al. )
* 2 高力価 レンチウイルス粒子として提供されます。
*3 レンチウイルスベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたもので、チューブあるいは96ウェルマイクロタイタープレートで提供されます。
* 4 shRNA 発現レンチウイルスベクターを用いた遺伝子発現抑制実験に必要な試薬をパッケージにしたキットです。
参考文献
1. McBride, J.L et al.(2008)Artificial microRNAs mitigate shRNA mediated toxicity in the brain: Implications for the therapeutic development of RNAi. PNAS
105(15):5868-5873.
2. Beer, S. et al.(2010)Low-level shRNA cytotoxicity can contribute to MYC induced hepatocellular carcinoma in adult mice. Molecular Therapy 18(1):161-170.
SMARTvector Lentiviral shRNA および SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA のノックダウン機能保証について
同一遺伝子(タンパク質をコードする遺伝子に限る)をターゲットとする3 種類以上の shRNA クローンを用いて実験を行った場合、そのうち1つについて、
mRNAレベルで70% 以上の遺伝子発現抑制を保証します。この機能保証期限は納品後 6ヶ月間となります。
下記条件を満たしたうえで、mRNA の発現抑制が70% に満たない場合には、1 回に限り交換品(1クローン)を提供いたします。機能保証の適用にあたっ
ては実験条件、結果等を詳細に確認させていただきますのであらかじめご了承願います。状況により交換品の提供ができない場合は、交換品(1クローン)
と同額の製品への交換とさせていただきますのであらかじめご了承ください。なお、この機能保証は、製品コードが V3S*xxxx である製品のみに適用され、
また、long noncoding RNA をターゲットとする製品には適用されません。
機能保証の実験条件
この機能保証では、使用する細胞に最適なプロモーターを搭載したターゲットshRNA クローンとともに non-targeting コントロールおよび GAPD/PPIB ポジティ
ブコントロール(いずれもターゲットshRNA クローンと同一のプロモーターおよび蛍光マーカーを搭載しているもの)を用いて同一条件下で同時に実験を行い、
ポジティブコントロールが十分に機能しているコントロール実験のデータが必須となります。
(1)SMARTvector Lentiviral shRNA の場合、使用する細胞に
最適なプロモーターは SMARTchoice promoter selection plate を用いて決定してください。ノックダウン効率は、ウイルス感染から72 時間以降に、non(2)SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA の場合、使用す
targeting コントロールを導入した細胞に対して定量 RT-PCR 法を用いて評価してください。
る細胞に最適なプロモーターは SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-pack を用いて決定してください。また、最適な doxycycline 濃度は
SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA Technical Manual にしたがって検討してください。ノックダウン効率は、doxycycline による誘導から72 時間
以降に、non-targeting コントロールを導入した細胞に対して定量 RT-PCR 法を用いて評価してください。
GIPZ shRNA Starter Kit および TRIPZ shRNA Starter Kit のノックダウン機能保証について
キット取扱説明書にしたがって Starter kit を使用した場合に適用されます。同一遺伝子をターゲットとする3 種類の shRNA クローンを用いて実験を行った場
合、そのうち1つについて、mRNAレベルで70% 以上の遺伝子発現抑制を保証します。この機能保証期限は納品後 6ヶ月間となります。
下記条件を満たしたうえで、mRNA の発現抑制が70% に満たない場合は1 回に限り交換品(1クローン)を提供いたします。なお、機能保証の適用にあたっ
ては、実験条件、結果等を詳細に確認させていただきますのであらかじめご了承願います。状況により交換品の提供ができない場合は、交換品(1クローン)
と同額の製品への交換とさせていただきますのであらかじめご了承ください。
機能保証の実験条件
この機能保証では、ターゲットshRNA クローンとともにキットに添付のポジティブコントロールを用いて同一条件下で同時に実験を行い、ポジティブコントロー
ルが十分に機能しているコントロール実験のデータが必須となります。ノックダウン効率は、Non-silencing ネガティブコントロールを導入した細胞に対して定
量 RT-PCR 法を用いて評価してください。また、すべてのトランスフェクション実験は、キットに添付のトランスフェクション試薬を用いてください。
2
SMARTvector Lentiviral shRNA
ターゲット遺伝子を効率的にノックダウンするようにデザインされた shRNA 配列を含む核酸配列をパッケージしたレンチウイルス粒子
です。本製品は、shRNA 専用のアルゴリズムによりデザインしたターゲット配列を、microRNA パスウェイにおいて効率よくプロセッ
シングされる SMARTvector universal scaffold に組み込んでいます。この scaffold は、内在性の microRNA 転写産物を模倣する
ようにデザインされており、Drosha/Dicer により正確にプロセッシングされるとともに、shRNA アンチセンス鎖の RISC への優先的
な取り込みを実現するため、より特異的な遺伝子ノックダウンが可能です。また、使用する細胞に最適なプロモーター(shRNA の発
現を駆動)を7 種類から選択可能です。さらに、2 種類の蛍光マーカーにより、導入効率を簡便にチェックできます(蛍光マーカー非
搭載タイプもあります)。本製品を用いることによって、より確実な shRNA の恒常的発現実験が可能です。
※
製品の購入に際しては、SMARTchoice Promoter Selection Plate(下図 )を用いて、使用する細胞に最適なプロモーターを必ず事前に検討・選択してください。
ベクター中の要素
説明
◦ ヒト・マウス・ラットの遺伝子に対応
5 ' LTR
5' long terminal repeat
◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA
Ψ
Psi パッケージングシグナル配列
RRE
Rev response element(完全長ウイルスゲノム
のパッケージング効率を向上)
SMARTchoice
promoters
7 種類のプロモーターから選択可能
の恒常的な発現を実現
◦ 使用する細胞に最適なプロモーターを7 種類から選択可能
◦ TurboGFP あるいは TurboRFP の同時発現によって shRNA
の発現を確認可能
◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を
tGFP
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
(TurboGFP 遺伝子)
tRFP
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
(TurboRFP 遺伝子)
薬剤選択可能
◦ Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット*
SMARTchoice
promoters
hCMV
耐性遺伝子をコードする転写産物の翻訳を実現)
hEF1α
SMARTchoice shRNA
mEF1α
CAG
PGK
Ψ
tGFP
RRE
or
tRFP
or
IRES
PuroR
WPRE
Puromycin 耐性遺伝子
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
PuroR
UBC
5' LTR
Internal ribosome entry site(リボソームが結
合するサイト。TurboGFP/RFP および Puromycin
IRES
mCMV
発現レンチウイルスベクター
shRNA
特長
3' SIN LTR
SMARTvector universal scaffold
None
SMARTvector
universal scaffold
内 在 性の microRNA 転 写 産 物を模 倣するよう
にデザイン
WPRE
Woodchuck hepatitis posttranscriptional
regulatory element(導入遺伝子の発現を促進)
3 ' SIN LTR
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
long terminal repeat
SMARTvector Lentiviral shRNA デザイン
TU(×105)= 8.0 4.0 2.0 1.0 0.5 0.25 8.0 4.0 2.0 1.0 0.5 0.25
Promoter
A
Empty
B
hCMV:humancytomegalovirus
C
mCMV:mousecytomegalovirus
D
hEF1α:humanelongationfactor1alpha
E
mEF1α:mouseelongationfactor1alpha
F
CAG:chickenβactinhybridpromoter
G
PGK:mousephosphoglyceratekinase
H
UBC:humanubiquitinC
SMARTchoice Promoter Selection Plate 製品概要
7 種類のプロモーターの制御下で TurboGFP 遺伝子、Puromycin 耐性遺伝子、
Non-targeting shRNA を共発現する SMARTvector Lentiviral shRNA ウイルス
粒子を、力価を変えて96ウェルプレートにアレイ化しています(各ウェル25 µL )
。
各細胞におけるプロモーター活性を TurboGFP の蛍光強度から簡便に評価する
ことができます。
Relative Expression(Normalized to NTC)
SerialDilutions
■mCMV
1.4
■ hCMV
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
MOI20
MOI10
MOI5
GAPDH
MOI20
MOI10
MOI5
RHOA-1
マウス CMV プロモーターは、マウス NIH/3T3 細胞において、
ヒト CMV プロモーターより効率的な遺伝子発現抑制を実現
マウ ス NIH/3T3 細 胞を プ レートにまき、 マウ ス GAPDH 遺 伝 子あるいは
RHOA-1 遺伝子をターゲットとする SMARTvector Lentiviral shRNA ウイルス
粒子(マウスあるいは、ヒトの CMV プロモーターを搭載)を MOI = 20 、 10 、 5
にて形質導入しました。形質導入から72 時間後に各遺伝子の発現抑制レベ
ルを評価しました。
* 高力価(1 × 10 8 ±20 % TU/mL )および超高力価(5 × 10 9 ±20 % TU/mL )フォーマットの製品をラインナップしています。
3
SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA
ターゲット遺伝子を効率的にノックダウンするようにデザインされた shRNA 配列を含む核酸配列をパッケージしたレンチウイルス粒子
です。本製品は、shRNA 専用のアルゴリズムによりデザインしたターゲット配列を、microRNA パスウェイにおいて効率よくプロセッ
シングされる SMARTvector universal scaffold に組み込んでいます。この scaffold は、内在性の microRNA 転写産物を模倣する
ようにデザインされており、Drosha/Dicer により正確にプロセッシングされるとともに、shRNA アンチセンス鎖の RISC への優先的
な取り込みを実現するため、より特異的な遺伝子ノックダウンが可能です。また、使用する細胞に最適なプロモーター(Tet-On 3G
アクチベータータンパク質の発現を駆動)を4 種類から選択可能です。さらに、2 種類の蛍光マーカーにより、導入効率を簡便にチェッ
クできます。最新のテトラサイクリン誘導系である Tet-on 3G システムを採用した本製品を用いることによって、より厳密に制御され
た shRNA の誘導的発現実験が可能です。
発 現 レンチ ウ イルスベクター
shRNA
製品の購入に際しては、SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Pack*1を用いて、使用する細胞に最適なプロモーターを必ず事前に検討・選択して
ください。
※
特長
ベクター中の要素
◦ ヒト・マウス・ラットの遺伝子に対応
5 ' LTR
◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA
Ψ
の誘導的な発現を実現
Psi パッケージングシグナル配列
Rev response element(完全長ウイルスゲノムの
RRE
パッケージング効率を向上)
◦ 使用する細胞に最適なプロモーターを4 種類から選択可能
◦ TurboGFP あるいは TurboRFP の同時発現によって shRNA
Tetracycline 応答エレメントを持つ誘導性のプロ
モーター(doxycycline の存 在 下で Tet-On 3G ア
クチベータータンパク質によって活性化)
PTRE3 G
の発現を確認可能
◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を
薬剤選択可能
◦ Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット*2
mCMV
PGK
mEF1α
hEF1α
PTRE3G
5' LTR
Ψ
PuroR 2a Tet-On 3G
tGFP
RRE
or
tRFP
SMARTchoice
promoters
SMARTchoice Inducible shRNA
SMARTvector
universal scaffold
A U2 OS cells, SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA with mCMV
50ng/mLDox
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
(TurboGFP 遺伝子)
tRFP
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
(TurboRFP 遺伝子)
SMARTvector
universal scaffold
内 在 性の microRNA 転 写 産 物を模 倣するように
デザイン
SMARTchoice
promoters
4 種類のプロモーターから選択可能
Puromycin 耐性遺伝子
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
3' SIN LTR
SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA デザイン
NoDox
tGFP
PuroR
WPRE
説明
5' long terminal repeat
2a
2a self-cleaving peptide(自己切断活性を持つ短い
ペプチド。Puromycin 耐性遺伝子産物および Tet-On
3G アクチベータータンパク質の同時発現を実現)
Tet-On 3 G
Doxycycline によって制御されるアクチベータータ
ンパク質(Doxycycline 存在下で PTRE3G に結合)
WPRE
Woodchuck hepatitis posttranscriptional
regulatory element(導入遺伝子の発現を促進)
3 ' SIN LTR
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
long terminal repeat
B Terminal Cell Density(U2 OS, mCMV promoter )
500ng/mLDox
900
■NTC No Dox
800
■ NTC 50 ng/mL Dox
■ NTC 500 ng/mL Dox
NTC
UBB
CellsperField
700
■ UBB No Dox
600
■ UBB 50 ng/mL Dox
■ UBB 500 ng/mL Dox
500
400
300
200
100
0
NTC
UBB
SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA は、doxycycline 濃度依存的に必須遺伝子のノックダウンを実現
U2OS 細胞に、non-targeting control shRNA(NTC )あるいは ubiquitin B(UBB )遺伝子をターゲットとする shRNA を発現する SMARTvector Inducible Lentiviral
shRNA ウイルス粒子(マウスの CMV プロモーターを搭載)を MOI=0.1にて形質導入しました。形質導入された細胞を1.5 µg/mL puromycin にて3 日間選択後、96ウェ
ルプレートにウェルあたり2,000 個の細胞を播きました。 1 日後、doxycycline にて shRNA の発現を5 日間誘導しました。細胞を Hoescht 33342 にて染色し、核(青)お
よび TurboGFP(緑)の発現をイメージアナライザーで解析しました(A )。また、Cell Titer-Glo assay(Promega )を用いて細胞の数をカウントし、フィールドあたりの細胞
密度を定量しました(18フィールドの平均)
(B )。
*1 4 種類の異なるプロモーター
(mCMV、PGK、mEF1 α、hEF1 α)を搭載した SMARTvector Inducible Non-targeting Control( TurboGFP 遺伝子発現タイプ)の各々
をチューブに分注し4 本セットとした製品です。各チューブに含まれるウイルス粒子の最小力価は 1 × 107 TU/mL、容量は25 µLです。
* 2 高力価(1 × 107 ± 20% TU/mL )フォーマットの製品をラインナップしています。
4
GIPZ Lentiviral shRNA*1
ヒトおよびマウス全ゲノムを網羅する shRNA コンストラクトを pGIPZレンチウイルスベクターに組み込むことによって構築されました。
GIPZ Lentiviral shRNA を用いることにより、特異的、安定的、効率的な RNAi 実験が可能です。大腸菌グリセロールストックおよ
び Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット*2の製品をご用意しています。GIPZ Lentiviral shRNA のお好みのクローン
(最大 3 種類)にコントロールベクターなどをセットにした GIPZ shRNA Starter Kit もラインナップしています(下表参照)。
特長
ベクター中の要素
説明
5 ' LTR
5' long terminal repeat
Ψ
Psi パッケージングシグナル配列
RRE
Rev response element(完全長ウイルスゲノムの
パッケージング効率を向上)
の恒常的な発現を実現
◦ ヒトの CMV プロモーターを採用
◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を
薬剤選択可能
tGFP
Revised versions
hCMV
PuroR
RRE
WPRE
Ψ
IRES
Ψ
tGFP
shRNA
pUC ori
5ʹ LTR
5' LTR
AmpR
Ψ
Ψ
Kit
5ʹ LTR
5' LTR
Viral
Starter
pUC
ori particle
SV40
ori
・GIPZ Lentiviral shRNA クローン(1 ∼ 3 種類)- 高力価レンチウイルス粒子(2 × 25 µL )
高力価レンチウイルス粒子
(1 × 25 µL )
・GIPZ GAPDH Lentiviral shRNA Positive
AmpR Control
pUC-ori
SV40 ori
・GIPZ Non-silencing Lentiviral shRNA Control - 高力価レンチウイルス粒子(1 × 25 µL )
U6
hPGK
RRE
PuroR
hPGK
shRNA
PuroR
Ψ
Ψ
117 %
RSV/5ʹ LTR
AmpR
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pLKO.1
RSV/5' LTR
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pLKO.1
pUC ori
Amp
GIPZ
Lentiviral
shRNA による効率的な遺伝子ノック
R
50
ダウン
SV40 ori
TP53-3
Ψ
18 %
7%
TP53-1
12 %
TP53-2
5ʹ LTR
8%
PTEN-2
PTEN-1
7%
MAPKAPK2-2
MAPK1-3
pUC ori
MAPK1-2
BUB1-3
BUB1-2
AmpR
WPRE
15 %
pSMART 2.0
MAPK1-1
11 %
BUB1-1
BRCA1-3
BRCA1-2
9%
microRNA
30 %
23 %
hCMV shRNA を OVCAR-8 細胞に MOI=0.4 ∼ 2にて
GIPZ Lentiviral
R 4
導入しました
(導入実験を
回行いました)
microRNA
2∼
RRE
tGFP
IRES Puro
WPRE。導入から48 時
25 %
間後に puromycin(30 µg/mL )で細胞の選択を開始しました。
導入から84 時間後の細胞から抽出した RNA を用いて定量 PCR
pSMART
2.0
を3 連で行いました
(18S rRNA を内部標準として使用)。 Nonsilencing ネガティブコントロールによるノックダウンとの比較で、
3つの GIPZ Lentiviral shRNA のうち平均 2つが70%以上のノック
3ʹ SIN LTR
5' LTR
32 %PuroR
3' SIN LTR
0
BRCA1-1
IRES
26 %
PTEN-3
tGFP
26 %
MAPKAPK2-3
RRE
40 %
MAPKAPK2-1
36 %
hCMV
39 %
Ψ
Remaining mRNA Expression(%)
5ʹ LTR
・GIPZ Lentiviral shRNA クローン(1 ∼ 3 種類)- 大腸菌グリセロールストック
hCMV
・GIPZ GAPDH Lentiviral shRNA Positive Control - 大腸菌グリセロールストック
RRE Positive
cPPT/CTSControl
tGFP- 大腸菌グリセロールス
IRES PuroR shRNA
WPRE
tGFP
IRES
shRNA WPRE
トック
・GIPZ EG5 Lentiviral shRNA
Transduction Starter Kit
・GIPZ Non-silencing Lentiviral shRNA Control - 大腸菌グリセロールストック
・Calcium phosphate transfection reagent
pSMART 2.0
pSMART
2.0
・Trans-Lentiviral packaging mix(
10 回分)
100
25
3ʹ SIN LTR
pTRIPZ
・GIPZ Lentiviral shRNA クローン(1 ∼ 3 種類)- 大腸菌グリセロールストック
・GIPZ GAPDH Lentiviral shRNA Positive Control - 大腸菌グリセロールストック
大腸菌グリセロールストック
・GIPZ EG5 Lentiviral shRNA Positive Control
-pUC
AmpR
ori
SV40 ori
・GIPZ Non-silencing Lentiviral shRNA Control - 大腸菌グリセロールストック
・TurboFect transfection reagent
PuroR
shRNA
pUC ori
rtTA3 IRES PuroR WPRE
hCMV
U6
RRE
UBC
tRFP
shRNA
キッ
ト内容
3' SIN LTR
製品名
Transfection
Starter Kit
SV40 ori
Ready-to-use の高力価レン
チウイルス粒 子をお求めの
AmpR
場合
75
WPRE
pUC ori
トランスフェクションの困難
RRE
な細胞用にレンチウイルス粒
子を自作したい場合
125
PuroR
RRE
Ψ
IRES
pTRIPZ
5' LTR
Ψ
rtTA3
shRNA
トランスフェクションの容易
な細胞を用いる場合 AmpR
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
long terminal repeat
TRE
UBC
目的
Woodchuck hepatitis posttranscriptional
regulatory
pUC ori element
SV40(
ori導入遺伝子の発現を促進)
AmpR
3 ' SIN LTR
pGIPZ ベクターの構造
tRFP
RRE Starter
GIPZ shRNA
Kit
shRNA
WPRE
SV40 ori
TRE
PuroR
Internal ribosome entry site(リボソームが結合
するサイト。TurboGFP および Puromycin 耐性遺
hCMV
伝子をコードする転写産物の翻訳を実現)
tGFP IRES PuroR
WPRE
Puromycin 耐性遺伝子
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
shRNA
内在性の microRNA 転写産物を模倣するように
pGIPZ
デザイン
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pGIPZ
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
(TurboGFP 遺伝子)
From PowerPoint
(R&D)
IRES
RRE
ヒトcytomegalovirus プロモーター
(ORF の発現を駆動)
hCMV
◦ TurboGFP の同時発現によって shRNA の発現を確認可能
発現レンチウイルスベクター
shRNA
◦ ヒト・マウスの遺伝子に対応
◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA
AmpR
pUC ori
ダウンを実現しました。
SV40 ori
Ψ
Multi Tag
Cloning Site
pLOC
3ʹ SIN LTR
pLOC
5ʹ LTR
Multi Tag
Cloning Site
3' SIN LTR
5' LTR
Ψ
*1 第 3 世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しません。レンチウイルス粒子へのパッケージングには Trans-Lentiviral shRNA Packaging System
hCMV
hCMV
(10ページ)の使用をおすすめします。
7
8
ORF
R
RRE Control の力価は
IRES
BlastR WPRE
-2aWPRE
tGFPnuc1 ×
ORFクローンの力価は
IRES
nuc -2a± 20%
∼10tGFP
です。
* 2 GIPZ Lentiviral shRNA
108Blast
TU/mL、GIPZ Lentiviral shRNA
1 × 10
TU/mL
5
TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA*
ヒト全ゲノムを網羅する shRNA コンストラクトを pTRIPZレンチウイルスベクターに組み込むことによって構築されました。TRIPZ
Inducible Lentiviral shRNA を用いることにより、誘導的な RNAi 実験が可能です。pTRIPZ ベクターにはテトラサイクリン誘導系で
ある Tet-On システムが 採 用されています。 大 腸 菌グリセロールストックの製 品をラインナップしています。TRIPZ Inducible
Lentiviral shRNA のお好みのクローン(最大 3 種類)にコントロールベクターなどをセットにした TRIPZ shRNA Starter Kit もラインナッ
プしています(下表参照)。
Revised versions
From PowerPoint (R&D)
特長
ベクター中の要素
hCMV
PuroR
WPRE
Ψ
shRNA
3' SIN LTR
の誘導的な発現を実現
5' LTR
pGIPZ
◦ TurboRFP の同時発現によって shRNA の発現を確認可能
◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を
AmpR
薬剤選択可能
pUC ori
Ψ
IRES
◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA
5ʹ LTR
tGFP
RRE
5 ' LTR
SV40 ori
RRE
Ψ
tGFP
UBC
rtTA3
IRES
PuroR
TRE
内在性の microRNA 転写産物を模倣するように
デザイン
UBC
ヒトubiquitin
rtTA3
IRES PuroR(rtTA3
WPREおよび PuroC プロモーター
mycin 耐性遺伝子の発現を駆動)
tRFP
UBC
5ʹ LTR
Ψ
5' LTR
pUC ori
SV40 ori
shRNA
Reverse tetracycline-transactivator 3( doxycycline
pTRIPZ存在下で TRE に結合し、TRE からの TurboRFP および shRNA の発現を活性化)
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
AmpR
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
pUC ori
SV40 ori
(TurboRFP 遺伝子)
TRE
shRNA
pTRIPZ
rtTA3
Internal ribosome entry site(リボソームが結合
pUC ori
SV40 ori
するサイト。rtTA3および Puromycin 耐性遺伝子
をコードする転写産物の翻訳を実現)
AmpR
IRES
pTRIPZ ベクターの構造
tGFP
IRES
PuroR
RRE
WPRE
shRNA
5' LTR
AmpR
pUC ori
AmpR
PuroR
Ψ
RSV/5' LTR
SV40 ori
pUC ori
PuroR
microRNA
WPRE
58 %
42 %
21 %
WPRE
19 %
pUC
ori
PRKAR2B
SV40 ori
DDR1
V2THS-92319
V2THS-92317
pLOC
V2THS-202770
V2THS-170431
V2THS-170430
V2THS-135377
V2THS-135381
Blast R
14 %
PTEN
Multi Tag
で shRNA の発現を誘導しました。導入から2 週間後の
doxycycline(1 µg/mL )
Cloning Site
細胞から抽出した RNA を用いて定量 PCR を3 連で行い( 18S rRNA を内部標準と
pLOC
3ʹ SIN LTR
V2THS-135378
Ψ
-2a-
14 %
3' SIN LTR
R
Amp
TNFRSF12A
tGFPnuc
IRES
14 % Multi Tag
Cloning Site
V2THS-263364
ORF
22 %
V2THS-221377
25
4 種類の遺伝子をターゲットとする TRIPZ Inducible Lentiviral shRNAレンチウイ
hCMV
ルス粒子(遺伝子あたり3 種類)を HEK293T 細胞に MOI = 0.3にて導入し、 48 時
ORF
RRE
IRES tGFPnuc -2a- BlastR WPRE
間後に puromycin( 5 µg/mL )で細胞の選択を開始しました。導入から
5 日後に
37 %
35 %
30 %
V2THS-231722
hCMV
V2THS-262746
50
pSMART 2.0
R
pUC
ori
SV40 ori
を用いた
TRIPZ InducibleAmp
Lentiviral
shRNA
低 MOI での誘導的な遺伝子ノックダウン
65 %
NS1
IRES
Ψ
AmpR
5ʹ LTR
pSMART 2.0
75
5' LTR
tGFP
Ψ
RRE
5ʹ LTR
Ψ
WPRE
100 %
NS1
pLKO.1
3ʹ SIN LTR
5' LTR
microRNA
3' SIN LTR
Remaining mRNA Expression(%)
PuroR
hPGK
・TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA クローン(1 ∼ 3 種類)- 大腸菌グリセロールストック
・TRIPZ Human GAPDH Inducible Lentiviral shRNA Positive Control - 大腸菌グリセロールストック
・TRIPZ Inducible Lentiviral Non-silencing
shRNA
pUC ori
AmpR Control - 大腸菌グリセロールストック
・Calcium phosphate transfection reagent
・Trans-Lentiviral packaging mix(10 回分)
hCMV
hCMV
IRES
SV40 ori
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pLKO.1
トランスフェクションの困難
pUC ori
AmpR Packaging Starter Kit
な細胞用にレンチウイルス粒
子を自作したい場合
0
pUC ori
・TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA クローン(1 ∼ 3 種類)- 大腸菌グリセロールストック
R
shRNA shRNA Positive ControlPuro
・TRIPZ Human GAPDHRRE
Inducible Lentiviral
- 大腸菌グリセロールストック
・TRIPZ Inducible Lentiviral Non-silencing shRNA Control - 大腸菌グリセロールストック
・TurboFect transfection reagent
Transfection Starter Kit
tGFP
WPRE
キット内容
shRNA
RRE
shRNA
U6
hPGK
トランスフェクションの容易
な細胞を用いる場合
PuroR
Ψ
RRE
IRES
Woodchuck hepatitis posttranscriptional
regulatory element(導入遺伝子の発現を促進)
製品名
U6
100
tGFP
RSV/5ʹ LTR
目的
cPPT/CTS
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
3 ' SIN LTRpSMART 2.0
long terminal repeat
SV40 ori
TRIPZ shRNA Starter Kit
125
WPRE
hCMV
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pSMART 2.0
5ʹ LTR
Ψ
Ψ
RRE
Puromycin 耐性遺伝子
PuroR
hCMV
WPRE
Tetracycline 誘導性プロモーター
AmpR
RRE
WPRE
Puro
Psi パッケージングシグナル配列
Rev response shRNA
element(完全長ウイルスゲノムの
パッケージング効率を向上)
pGIPZ
tRFP
Ψ
TRE
tRFP
IRES
RRE
shRNA
RRE
説明
5' long Rterminal repeat
3ʹ SIN LTR
発 現 レンチ ウ イルスベクター
shRNA
hCMV
◦ ヒトの遺伝子に対応
して使用)、各ターゲット遺伝子のノックダウンを評価しました。 TRIPZ Inducible
Lentiviral Non-silencing shRNA Control(NS1)によるノックダウンと比較した結
果を示しました。ノAmp
ックダウン実験は
2 回行いました。
R
pUC ori
SV40 ori
* 第 3 世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しません。レンチウイルス粒子へのパッケージングには Trans-Lentiviral shRNA Packaging System
(10ページ)の使用をおすすめします。
mCMV
hEF1α
mEF1α
CAG
SMARTchoice shRNA
ARTchoice
romoters
SMARTchoice
promoters
hCMV
6
hCMV
mCMV
hEF1α
mEF1α
CAG
hCMV
hCMV
WPRE
Ψ
IRES
RRE
shRNA
5ʹ LTR
5' LTR
WPRE
pGIPZ
SV40 ori
AmpR
TRC Lentiviral shRNA
pUC ori
SV40 ori
UBC
TRE
UBC
TRE
PuroR
3ʹ SIN LTR
pUC ori
IRES
shRNA
3' SIN LTR
pGIPZ
AmpR
tGFP
Ψ
tGFP
RRE
PuroR
RRE
tRFP コンストラクトを
rtTA3
IRES レンチウイルスベクタ
PuroR WPRE
(TRC )により、ヒ
ー
The RNAi RRE
Consortium
shRNA
pLKO.1
IRES トおよびマウス全ゲノムを網羅する
Puro
tRFP
rtTA3
WPRE
Ψ
R
Ψ
に組み込むことによって構築されました。大腸菌グリセロールス
トックの製品をラインナップしています。
shRNA
shRNA
AmpR
pUC ori
ベクター中の要素
AmpR
SV40 ori
◦ ヒト・マウスの遺伝子に対応
tGFP
RRE
IRES
PuroR
ンチウイルスを強力に転写)
hCMV
RRE
Ψ
WPRE
shRNA
Ψ
Ψ
5ʹ LTR
5' LTR
◦ ヒトの U6プロモーターを採用
◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を
AmpR
薬剤選択可能
pUC ori
SV40 ori
pSMART 2.0
ヒトU6プロモーター
(RNA polymerase III、shRNA の発現を駆動)
U6
AmpR
shRNA
hPGK
shRNA
RRE
PuroR
Ψ
Ψ
RRE
RSV/5ʹ LTR
RSV/5' LTR
AmpR
pUC ori
ヒトphosphoglycerate kinase プロモーター
(Puromycin 耐性遺伝子の発現を駆動)
hPGK
Puromycin 耐性遺伝子
PuroR
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
shRNA
PuroR
SV40 ori
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pLKO.1
pUC ori
シンプルヘアピン型の shRNA
U6
hPGK
U6
Rev response element(完全長ウイルスゲノム
のパッケージング効率を向上)
3ʹ SIN LTR
RRE
3' SIN LTR
pSMART 2.0
tGFPPsi IRES
PuroR shRNA WPRE
パッケージングシグナル配列
cPPT/CTS
発現レンチウイルスベクター
shRNA
◦ in vitro および in vivo における安定期な遺伝子ノックダウン
を実現
SV40 ori 説明
pUC ori
RSV プ ロ モーター /5' long terminal repeat
(パッケージング細胞において Tat 非依存的にレ
RSV/5 ' LTR
◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA
の恒常的な発現を実現hCMV
pTRIPZ
5ʹ LTR
5' LTR
特長
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pTRIPZ
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
pLKO.1
long
terminal repeat
3 ' SIN LTR
pUC ori
AmpR
pTRIPZ ベクターの構造
hCMV
hCMV
tGFP
microRNA
PuroR
WPRE
RRE
tGFP
IRES
PuroR
microRNA
WPRE
Ψ
IRES
100
AmpR
pSMART 2.0
5ʹ LTR
125
2.0
■ 実験 2
SV40 ori
pUC ori
3ʹ SIN LTR
pSMART
■ 実験 1
3' SIN LTR
AmpR
pUC ori
SV40 ori
75
shJAK2
pUC ori
shERBB3
shFGFR1
SV40 ori
shFYN
shIGF1R
AmpR
pUC ori
SV40 ori
HP5
HP4
HP3
HP2
HP1
HP5
HP4
pLOC
tGFPnuc -2a- BlastR WPRE
HP3
HP2
Multi Tag
Cloning Site
HP1
HP4
HP3
HP2
HP4
HP3
HP2
HP5
HP1
HP4
HP3
HP2
HP1
HP5
HP4
HP3
HP2
HP1
pLOC
IRES
3ʹ SIN LTR
AmpR
ORF
RRE
WPRE
Blast R
HP5
-2a-
Ψ
tGFPnuc
Multi Tag
Cloning Site
0
5' LTR
hCMV
IRES
HP1
25
ORF
HP5
hCMV
5ʹ LTR
50
3' SIN LTR
Remaining
mRNA Expression
Ψ
5'(
LTR%)Ψ
RRE
shMST1R
TRC Lentiviral shRNA を用いた遺伝子ノックダウン
A549 細胞で発現する6つのチロシンキナーゼ遺伝子を、 30 種類の shRNA を用いてノックダウンする実験を2 回行い(実験 1および2)、各遺伝子の発現量を定量 PCR
で解析しました。 6つのどの遺伝子についても、少なくとも1 種類の shRNA が mRNAレベルを70%以上低減させました。 Moffat et al.(2006 )の一部改変データ*。
mCMV
hEF1α
mEF1α
CAG
PGK
SMARTchoice
promoters
SMARTchoice
promoters
hCMV
SMARTchoice shRNA
UBC
5' LTR
Ψ
tGFP
RRE
or
tRFP
IRES
PuroR
WPRE
SMARTvector universal scaffold
3' SIN LTR
5ʹ LTR
Ψ
RRE
hCMV
mCMV
hEF1α
mEF1α
CAG
PGK
UBC
tGFP
or
tRFP
IRES
PuroR
WPRE 3ʹ SIN LTR
SMARTvector2.0 universal scaffold
SMARTchoice shRNA
* Moffat, J. et al.(2006)A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high content screen. Cell 124:1283-1298.
7
shRNA発現レンチウイルスベクターライブラリー
最新の研究報告やデータベースに由来する遺伝子情報やオントロジー情報を反映した shRNA 発現レンチウイルスベクターのライブラ
リーをラインナップしています。本ライブラリーは、最先端のバイオインフォマティクスツールを利用して編成されています。
下表を参考にして研究目的に合ったヒトおよびマウス遺伝子をターゲットとするshRNA 発現レンチウイルスベクターライブラリー
をご選択ください。
ヒトライブラリー製品
GIPZ
TRIPZ
TRC
マウスライブラリー製品
GIPZ
TRC
発 現 レンチ ウ イルスベクター
shRNA
Angiogenesis
ー
ー
●
Angiogenesis
●
●
Apotosis
ー
ー
●
Apotosis
●
●
Cell Cycle
ー
ー
●
Cancer
ー
●
Druggable Genome
●
ー
ー
Cell Cycle
●
●
Drug Target
●
ー
ー
Druggable Genome
ー
●
GPCR
●
ー
●
GPCR
ー
●
Ion Channel
●
ー
ー
Protease
ー
●
Phosphatase
●
ー
●
Protein Kinase
●
●
Protease
●
ー
ー
Transcription Factor
●
●
Protein Kinase
●
ー
●
Ubiquitin
●
●
Transcription Factor
ー
ー
●
Ubiquitin Ligase
●
●
Ubiquitin
ー
ー
●
Whole Genome
●
●
Ubiquitin Conjugation Subset 1
●
ー
ー
Ubiquitin Conjugation Subset 2
●
ー
ー
Ubiquitin Conjugation Subset 3
●
ー
ー
Ubiquitin Ligase
ー
ー
●
Whole Genome
●
●
●
GPCRs
Proteases
Ion Channels
Ubiquitin Conjugation
(Subsets 1, 2, 3)
Kinases
Phosphatases
Drug Targets
Drug Target Subcategories
8
Anti-apoptosis
Autophagy
Enzymes
Transcription Regulators
Transporters
Transmembrane Receptors
GPCR Signaling
DNA Repair
Translation Regulators
Druggable genome ライブラリーの内訳
Senescense
Nuclear Receptors
創薬ターゲットとなりうる遺伝子を発現抑制する
Apoptosis Signaling
shRNA を含みます。創薬ターゲット遺伝子カテゴ
Cell Cycle
リーの内訳を左に示します。
Decode Pooled Lentiviral shRNA Libraries
本ライブラリーは、shRNA を発現する GIPZ Lentiviral shRNAレンチウイルス粒子(5ページ)を遺伝子ファミリーごと、あるいは全ゲ
ノムレベルで混合してプールとした製品です。本製品を細胞に感染させてヒト遺伝子を網羅的に発現抑制し、目的の表現型(特定の
選択条件下で生存可能あるいは増殖速度が変化するなどを指標に用いる)を細胞に与える shRNA 配列をスクリーニングします。
illumina シークエンサーにのみ対応した製品です。
特長
◦ ヒトの遺伝子に対応
◦ 濃縮した高力価レンチウイルス粒子(≧1 × 108 TU/mL )
◦ 小規模の遺伝子ファミリーからゲノムワイドな解析が
可能な製品まで充実のラインナップ(右表)
ターゲット遺伝子数
プール数 × プールあたりの shRNA数
571
254
709
374
382
478
7 ,494
18 ,205
1 プール × 3 ,830 shRNA
1 プール × 1 ,561 shRNA
1 プール × 4 ,675 shRNA
1 プール × 1 ,884 shRNA
1 プール × 2 ,591 shRNA
1 プール × 2 ,559 shRNA
5 プール × 8 ,490 shRNA
10 プール × 9 ,570 shRNA
発現レンチウイルスベクター
shRNA
として提供
ライブラリー
Ubiquitin Conjugation
Phosphatase
Protein Kinase
Ion Channel
GPCR
Protease
Druggable genome
Human genome
※ 表中の数字は、参照データベースの変更等により変更になる場合があります。
Decode Pooled shRNA Screening Library を用いたスクリーニングワークフロー
感染条件の検討
スクリーニングパラメーターの検討
Step 1
アッセイ系の開発および至適化
選択圧
レンチウイルスの感染条件(感染に用いる培地、感染時間、細胞密
度等)やスクリーニングパラメーター(アッセイの時間、選択圧等)を
決定します。
shRNA を発現するレンチウイルスプールの感染
Step 2
一次スクリーニング
レンチウイルス感染細胞の選抜
細 胞あたり1 種 類の shRNA 配 列を発 現させるために、レンチウイ
ルスを低い MOI で細 胞に感 染させます。レンチウイルスの感 染し
た細 胞を、 対 照 用 サンプルと選 択 圧をかける処 理 用 サンプルに
分けます。 処 理 用 サンプルに選 択 圧をかけた後、 対 照 用 サンプ
ルおよび 処 理 用 サンプ ルのそれぞれからゲ ノム DNA を 抽 出しま
対照用サンプル
処理用サンプル
選択圧
す。 Illumina-adapted プライマーおよび Phusion Hot Start II
High-Fidelity DNA Polymerase を用いて、ゲノム中に挿入され
た shRNA 配列を PCR 増幅し、アダプター付加した PCR 増幅断片を
illumina flow cell に固定化します。結果的に生じるアンプリコンを
Illumina シークエンサーによりシークエンシングします。
表現型選抜
Log
Experimental/Reference
Log
Experimental/Reference
Log
Experimental/Reference
ゲノム DNA の調製および shRNA 配列のシーケンシング
増加した shRNA 配列
Step 3
減少した shRNA 配列
ヒットの同定
スクリーニング中に増減した shRNA 配列をヒットと見なし、それらヒッ
トshRNA がターゲットとする遺伝子を同定します。
Log mean counts
Log mean counts
Log mean counts
参考文献
1. Gazin, C. et al.(2007)An elaborate pathway required for Ras mediated epigenetic silencing. Nature 449: 1073-1077.
2. Gobeil, S. et al.(2008)A genomewide shRNA screen identifies GAS1 as a novel melanoma metastasis suppressor gene. Genes and Development 22: 2932-2940.
3. Hurov, K.E. et al.(2010)A genetic screen identifies the triple T complex required for DNA damage signaling and ATM and ATR stability. Genes and Development 24:
1939-1950.
4. Schalbach, M.R. et al.(2008)Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Science 319: 620-624.
5. Silva, J.M. et al.(2008)Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319: 617-620.
6. Westbrook, T.F. et al.(2005)A genetic screen for candidate tumor suppressors identifies REST. Cell 121: 837-848.
9
Trans-Lentiviral shRNA Packaging Kit
shRNA 発現レンチウイルスベクター用の安全・高効率パッケージングシステムです。Packaging mix とレンチウイルスベクターを
HEK293T パッケージング細胞にコトランスフェクションすることによってパッケージングを行います。
Packaging Cell
特長
◦ 多用途性:第 2または第 3 世代のレンチウイルスベクターの
Viral Proteins
Packaging Mix
効率的なパッケージングが可能です。
◦ 卓越したバイオセーフティー:ウイルスゲノムのパッケージン
発 現 レンチ ウ イルスベクター
shRNA
グに必要なタンパク質をコードしている遺伝子を5つのプラス
ウイルスの組み立て
および出芽
RNA
Transfection
ミドに分け、自己複製能を持つ組み換えウイルスの生じるリ
スクを低減しています。
◦ 幅広い細胞指向性:非分 裂 細 胞 を 含 む 哺 乳 動 物 細 胞に
in vitro および in vivo において効率的に形質導入するレン
チウイルス粒子を作成します。
Transcription
shRNAを含む
レンチウイル
スベクター
ウイルス上清の
回収
6
力価 1∼5 × 10 TU/mL
自己複製能の
ないウイルス
◦ 高力価:1 ∼ 5 × 10 6 TU/mL の力価が得られます。
Transduce Cells
キット内容
Trans-Lentiviral shRNA packaging Kit による
ウイルスパッケージング
◦ Trans-Lentiviral Packaging Mix
◦ HEK293T Packaging Cell
◦ CaCI 2 Reagent
◦ 2X HBSS reagent
◦ pGIPZ Non-silencing Control Vector DNA
TurboFect Transfection Reagent
TurboFect Transfection Reagent は、高効率・簡便・非免疫原性のトランスフェクション試薬です。本試薬は、カチオン性のポリマー
を水に溶解した滅菌済みの製品です。このポリマーは、DNA とともにコンパクトで安定的・正に帯電した複合体を形成します。これ
らの複合体は、DNA を分解から保護し、真核細胞への遺伝子導入を促進します。
特長
TurboFect Transfection Reagent を用いて DNA 導入に成功した細胞
◦ さまざまな細胞へのトランスフェクションに最適
◦ 血清の共在・非共在にかかわらずトランスフェクション可能
不死化した細胞株
B50, BHK21, Calu1, CHO, COLO, COS-7, HEK293,
HeLa, HeLa S3, Hep2C, HepG2, Jurkat, L929,
RAW264, MDCK, NIH/3T3, Sp2/Ag14, WEHI
初代培養細胞
ヒト肺線維芽細胞、ラット線維芽細胞、マウス骨
髄由来樹状細胞、マウス骨髄由来マクロファージ
◦ リピッドベースあるいはほかのポリマーベースのトランスフェク
ション試薬と比較してより高いトランスフェクション効率と低
毒性を実現
◦ 簡便なトランスフェクションプロトコール
■Transfection efficiency
1,250
1,000
50
750
500
25
250
UT
TurboFect 競合A社
製品
競合B社
製品
0
1,500
1,250
40
1,000
30
750
20
500
10
0
250
UT
TurboFect 競合A社
製品
競合B社
製品
0
GFP Positive Cells(%)
1,500
GFP Positive Cells(%)
1,750
75
0
50
2,000
Mean Fluorescence Intensity
GFP Positive Cells(%)
100
HepG2 Cells
■ Mean fluorescence intensity
60
1,500
50
1,250
40
1,000
30
750
20
500
10
250
0
UT
TurboFect 競合A社
製品
競合B社
製品
Mean Fluorescence Intensity
WEHI Cells
Mean Fluorescence Intensity
HeLa Cells
0
TurboFect Transfection Reagent は、幅広い細胞株において、高いトランスフェクション効率およびプラスミドからの遺伝子発現を実現
3 種類の細胞に、上図に記載のトランスフェクション試薬を用いて、enhanced GFP(eGFP )をコードするプラスミド DNA をトランスフェクションしました(UT: トランスフェ
クションしないコントロール)。トランスフェクションは、各試薬の推奨プロトコールにしたがって行い、フローサイトメーターを用いて GFP の発現を解析しました。
10
cDNA/ORF クローンコレクション製品選択ガイド
cDNAおよび ORFクローンの構造について
cDNA および ORF クローンを用いることにより、RNA 転写産
物の構 造に関する最も確かな情 報が得られます。cDNA ク
ローンは、タンパク質コード領 域(Open reading frame、
ORF )や非翻訳領域(Untranslated region、UTR )内の制
御配列などの実際の RNA 配列を正確に反映します。
弊社では、完全長 cDNA および ORF クローンを幅広くライン
ORF
5' UTR
3' UTR
完全長 cDNA クローンの構造
attクローンは、全長 ORF のほかに、5' 末端と3' 末端に
attUTR の一部
完全長 cDNA
または全部を含みます。
5' UTR
att
ナップしています。ヒト・マウス・ラット・ウシの全ゲノムをほ
ORF
ORF
3' UTR
att
ORF
完全長 ORF クローンの構造
ぼ網羅する cDNA クローン、ご希望の発現ベクターに ORF を
完全長 ORF クローンは、完全長 cDNA クローンから UTR を取り除いた ORF で
容易に移し変えることのできる Gateway 対応の ORF クロー
す。弊社の提供する ORF クローンは、Gateway 対応のデスティネーションベク
ン、すぐに遺伝子過剰発現実験に使用できるレンチウイルス
ターに ORF を容易に移し変えることのできるように、UTR が組み換え用クロー
ニングサイト(att サイト)に置き換わっています。
ベースの ORF 発現ベクターなどがあります。
下表を参考にして研究目的に合った cDNA/ORF クローンをご選択ください。
cDNA
生物種
全塩基配列確認済*1
Expression-ready
(すぐに遺伝子発現実験に使用可能)
Expression-to-transfer
蛍光マーカー
Mammalian
Gene Collection
(MGC )
CCSB Human
ORFeome
Human
ORFeome V8 .1
ORFeome
Collaboration
CCSB-Broad
Lentiviral
Expression
ORF Library
Precision
LentiORF
ヒト・マウス・
ラット・ウシ
ヒト
ヒト
ヒト・マウス
ヒト
ヒト
ー
●
●
●
●
一部の製品
ー
ー
ー
●
●
ー
●
●
●
ー
ー
ー
ー
ー
ー
ー
TurboGFP
● *2
クローンコレクション
cDNA/ORF
(Gateway対応のエントリークローン)
ORF
大腸菌グリセロール
ストック*3
製品フォーマット
大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール
ストック*3
ストック*3
ストック*3
ストック*3
ストック*3
高力価
ウイルス粒子*4
Precision LentiORF
Starter Kit*5
掲載ページ
*1
*2
*3
*4
*5
P12
P12
P12
P12
P13
P13
公的研究機関で検証したものです。弊社では塩基配列を確認していません。
一部のヒトの MGC cDNA クローン(製品コード:MHS6278)については弊社で塩基配列を確認しています。
プラスミドベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたもので、チューブあるいは96ウェルマイクロタイタープレートで提供されます。
高力価 レンチウイルス粒子として提供されます。
遺伝子過剰発現実験に必要な試薬をパッケージにしたキットです。
cDNA/ORF クローン製品(旧 Open Biosystems 製品)のご使用に際して
cDNA/ORF クローン製品は、研究機関から供給を受けたクローンを提供している関係上、公開されている製品情報とは異なるクローンが含まれるなどの不
具合がみられる可能性があります。これらの製品については、クローンの妥当性をシークエンシングにより使用前に確認いただくようお願いいたします。不
具合が考えられた製品については、シークエンシングデータ(少なくとも3つの独立したコロニーから得たもの)を提供いただいたうえで、弊社にて不具合が
確認できた場合、可能な限り正しい配列をもつ同等クローンを交換品として提供いたします。この交換品の提供期限は納品後 6ヶ月間となります。状況に
より同等クローンの提供ができない場合は、同額の製品への交換または契約金額の返金とさせていただきますのであらかじめご了承ください。
11
Mammalian Gene Collection(MGC )
米国国立衛生研究所をはじめとする多くの研究機関の共同
プロジェクトにより作成された、ヒト・マウス・ラット・ウシの
完全長 cDNA クローンコレクションです 1)、2 )、3 )。大腸菌グリ
セロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。
特長
◦ ヒト・マウス・ラット・ウシの全ゲノムをほぼ網羅
MGCの cDNA
クローン数
MGCの Non-redundant
遺伝子数
ヒト
マウス
ラット
ウシ
29 ,818
27 ,285
6 ,763
9 ,104
17 ,592
17 ,701
6 ,486
8 ,724
※ 表中の数字は、参照データベースの変更等により変更になる場合があります。
◦ 各クローンの cDNA 塩基配列を確認済み*1、2
◦ 一部のクローンは、すぐに遺伝子発現実験に使用可能
エントリークローン
att
CCSB Human ORFeome
Collection
本クローンコレクションは、Dana - Farber Cancer Institute
の Center for Cancer System Biology(CCSB )において作
成されました。これらのクローンは、MGC の完全長 cDNA を
鋳型とした PCR により得られた ORF を、Gateway 対応のエ
ントリーベクターにクローニングすることによって作成されまし
た4 )。Fidelity の高い DNA Polymerase を用い、少ないサイ
クル数(25サイクル)で各 ORF を増幅しているため、PCR に起
因する塩基配列の変異の発生が最小限に抑えられています。
大腸菌グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップ
しています。
特長
◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅
att
ORF
att
att
ccdB
デスティネーションクローン
att
att
ORF
発現クローン
タンパク質精製
タンパク質の
細胞内局在性解析
遺伝子過剰発現
Gateway システムによる、発現ベクターへの ORF 配列の移動
Gateway システムによって、Gateway 対応のエントリークローンから、さまざ
◦ Gateway 対応のエントリークローン
まな種類のデスティネーションクローンに容易に ORF を移し変えることができま
◦ ORF の終止コドンが除かれているため、 C 末端へのタグ
す。そのため、発現クローンの構築に要する手間と時間を低減することができ、
ク ローンコレクション
cDNA/ORF
等の付加が可能
さまざまな実験系の構築が容易になります。
Human ORFeome V8.1
本クローンコレクションは、Dana - Farber Cancer Institute の Center for Cancer System Biology(CCSB )において作成された、
最新バージョンの Human ORFeome Collection です。以前のバージョンのコレクションより各クローンの ORF 塩基配列の確度が向上
しています。大腸菌グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。
特長
◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 ◦ 各クローンの ORF 塩基配列を確認済み*1
◦ Gateway 対応のエントリークローン ◦ ORF の終止コドンが除かれているため、 C 末端へのタグ等の付加が可能
ORFeome Collaboration Collection
ヒト・マウスの塩基配列確認済み ORF を Gateway 対応のエントリーベクターに挿入したクローンコレクションです。Dana - Farber
Cancer Institute の Center for Cancer System Biology(CCSB )をはじめとする世界中のゲノム研究組織の共同プロジェクトにより
コレクションが整備されました。大腸菌グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。
特長
◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 ◦ 各クローンの ORF 塩基配列を確認済み*1
◦ Gateway 対応のエントリークローン ◦ ORF の終止コドンのあるクローンと除かれているクローンの両方をラインナップ
1 ) MGC Program Team(2002)Generation and initial analysis of more than 15,000 Full-length Human and Mouse cDNA Sequences. PNAS 99(26)
: 16899-16903.
. Genome
2 ) MGC Project Team(2004)The status, quality, and expansion of the NIH Full-length cDNA Project: The Mammalian Gene Collection(MGC )
Res. 14: 2121-2127.
. Genome Res. 19: 2324-2333.
3 ) MGC Project Team(2009)The completion of the Mammalian Gene Collection(MGC )
4 ) Lamesch, P. et al.(2007)hORFeome v3.1: A resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics 89:307-315.
*1 公的研究機関で検証したものです。弊社では塩基配列を確認していません。
*2 一部のヒトの MGC cDNA クローン
(製品コード:MHS6278)については弊社で塩基配列を確認しています。
12
Revised versions
From PowerPoint (R&D)
hCMV
hCMV
tGFP
RRE
IRES
PuroR
RRE
WPRE
tGFP
IRES
PuroR
WPRE
Ψ
Ψ
CCSB-Broad
Lentiviral Expression Library *1
pGIPZ
shRNA
5ʹ LTR
5' LTR
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
shRNA
pGIPZ
本製品は、Dana - Farber Cancer Institute および Broad Institute において作成されました。各クローンは、Gateway システムに
ー pLX304-Blast-V5
に移し変えることにより作成されま
より、Human ORFeome
V8.1
AmpR
pUC
ori の ORF
SV40 をレンチウイルスベースの発現ベクタ
ori
AmpR
pUC ori
SV40 ori
した。レンチウイルスベースの発現ベクターを採用しているため、さまざまな細胞において遺伝子発現実験に使用可能です。大腸菌
グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。
RRE
UBC
tRFP
rtTA3
ベクター中の要素
IRES
PuroR
WPRE
Ψ
◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅
Ψ
RRE
5' LTR
説明
tRFP
3' SIN LTR
5' LTR
pTRIPZ
◦ ヒトの CMV プロモーターを採用
◦ V5タグとの融合タンパク質として ORF を発現
pTRIPZ
RRE
パッケージング効率を向上)
PGK
Amp
pUC ori
SV40 ori
◦ Blasticidin 耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を薬剤
R
AmpR
hCMV
Blasticidin 耐性遺伝子
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
tGFP
RRE
WPRE
ORF V5 stop
hCMV
ORF
RRE
V5
ヒトcytomegalovirusプロモーター(ORF の発現を駆動)
hCMV
Open reading frame(タンパク質コード領域)
tGFP IRES PuroR shRNA WPRE
V5エピトープタグ
IRES
PuroR
WPRE
shRNA
5' LTR
5' LTR
AmpR
pUC ori
AmpR
WPRE
F1 ori
pUC ori
3' SIN LTR
SV40 ori
AmpR
pLX304-Blast-V5 ベクターの構造
Precision LentiORF Collection *1
hPGK
U6
shRNA
RRE
PuroR
pUC ori
SV40 ori
U6
hPGK
shRNA
PuroR
Ψ
RRE
Woodchuck hepatitis posttranscriptional
regulatory element(導入遺伝子の発現を促進)
pSMART 2.0
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
long terminal repeat
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
3' SIN LTR
pLX304-Blast-V5
pSMART 2.0
cPPT/CTS
Ψ
R
BsdhCMV
5ʹ LTR
PGK
RRE
ヒトの phosphoglycerate kinase(PGK )遺伝子プロ
モータ
ー(ori
BsdR の発現を駆動)
pUC
SV40 ori
Bsd
R
選択可能
3ʹ SIN LTR
rtTA3 IRES PuroR WPRE
5' long terminal repeat
パッケージングシグナル配列
Psi
shRNA
Rev response element(完全長ウイルスゲノムの
Ψ
shRNA
◦ 各クローンの ORF 塩基配列を確認済み*2
Ψ Ψ
UBC
TRE
TRE
5ʹ LTR
特長
Ψ
RSV/5ʹ LTR
RSV/5' LTR
3' SIN LTR
3ʹ SIN LTR
本クローンコレクションは、ORFeome Collaboration Collection の ORF をレンチウイルスベースの発現ベクター pLOC に挿入すること
pLKO.1
により作成されました。レンチウイルスベースの発現ベクターを採用しているため、さまざまな細胞において遺伝子発現実験に使用
pLKO.1
可能です。大腸菌グリセロールストックおよび Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット*3の製品をラインナップしてい
トロールベクタ
ーなどをセットにした Precision
ます。Precision
pUC oriLentiORF
Collection のお好みの ORF クローン(最大 2 種類)にコン
AmpR
pUC ori
AmpR
LentiORF Starter Kit もラインナップしています(下表参照)。
ベクター中の要素
hCMV
tGFP
IRES
microRNA
PuroR
WPRE
Ψ
RRE
◦ヒトの全ゲノムをほぼ網羅
Ψ
◦各クローンの ORF 塩基配列を確認済み*2
5ʹ LTR
5' LTR
◦カスタムタグとの融合タンパク質として ORF を発現可能
SV40 の発現を確認可能
ori
AmpR
pUC ori
◦ TurboGFP の同時発現によって
ORF
IRES
◦ Blasticidin 耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を薬剤
tGFPnuc
-2a-
Blast R
WPRE
Ψ
IRES
Multi Tag
Cloning Site
5' LTR
pUC ori
BlastR
WPRE
SV40 ori
3' SIN LTR
pLOC ベクターの構造
R WPRE
ORF
IRES tGFPpeptide
nuc -2a- Blast
2a self-cleaving
(自己切断活性を持つ短いペプチド。
TurboGFP およ
Multi Tag
Cloning
Site
耐性タンパク質の同時発現を実現)
び Blasticidin
Blasticidin
pLOC 耐性遺伝子
RRE
2a
(遺伝子形質導入細胞の選択マーカー)
AmpR
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pLOC
5ʹ LTR
ORF
Internal ribosome entry site(リボソームが結合する
pUC ori
SV40 ori
サイト。TurboGFP および Blasticidin 耐 性 遺 伝 子を
遺伝子形質導入と発現の確認マーカー
hCMV
(核移行シグナルを付加した TurboGFP 遺伝子)
tGFPnuc
hCMV
Ψ
AmpR
タンパク質精製用または発現確認用タグ配列の追加
に便利なクローニングサイト
コードする転写産物の翻訳を実現する)
選択可能
AmpR
hCMV
ORF
pSMART 2.0
Multi Tag
Cloning Site
hCMV
5' long terminal repeat
tGFP
IRES PuroR microRNA WPRE
Psi パッケージングシグナル配列
ヒトcytomegalovirusプロモーター(ORF の発現を駆動)
Open reading frame(タンパク質コード領域)
3ʹ SIN LTR
3' SIN LTR
pSMART 2.0
◦ヒトの CMV プロモーターを採用
説明
5' LTR
RRE
Ψ
クローンコレクション
cDNA/ORF
特長
Woodchuck hepatitis posttranscriptional
(導入遺伝子の発現を促進)
regulatory
pUC ori element
SV40
ori
3' 末端の自己不活性化(self inactivating )
long terminal repeat
Precision LentiORF Starter Kit
hCMV
mCMV
hEF1α
トランスフェクションの容易な
mEF1α
細胞を用いる場合
CAG
PGK
製品名
UBC
トランスフェクションの困難な
細胞用にレンチウイルス粒子を
Transduction Starter Kit
PuroR
IRES
tGFP
Ψ RRE
5' LTR
自作したい場合
or
tRFP
Ready-to-useの高力価レンチ
ウイルス粒子をお求めの場合
キット内容
hCMV
トック
・Precision LentiORF クローン(1 ∼ 2 種類)- 大腸菌グリセロールス
mCMV
hEF1α
トック
・Precision LentiORF RFP Positive Control - 大腸菌グリセロールス
Transfection
StartershRNA
Kit
SMARTchoice
mEF1α
・TurboFect transfection reagent
SMARTchoice
promoters
SMARTchoice
promoters
目的
SMARTvector universal scaffold
・Precision
Viral particle Starter Kit
CAG
PGK
トック
・Precision LentiORF クローン(1 ∼ 2 種類)- 大腸菌グリセロールス
UBC
トック
・Precision LentiORF RFP Positive Control - 大腸菌グリセロールス
・Calcium
transfection reagent
WPRE
3' SIN phosphate
LTR
5ʹ LTR
tGFP IRES PuroR
Ψ RRE
・Trans-Lentiviral packaging mix(10 回分)
or
WPRE 3ʹ SIN LTR
tRFP
(2 × 25 µL )universal scaffold
LentiORF クローン(1 ∼ 2 種類)- 高力価レンチウイルス粒子
SMARTvector2.0
・Precision LentiORF RFP Positive Control - 高力価レンチウイルス粒子(1 × 25 µL )
SMARTchoice shRNA
*1 第 3 世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しません。レンチウイルス粒子へのパッケージングには Trans-Lentiviral ORF Packaging System
(14ページ)の使用をおすすめします。
* 2 公的研究機関で検証したものです。弊社では塩基配列を確認していません。
(≧ 1 × 108 TU/mL )フォーマットの製品をラインナップしています。
*3 高力価
13
cDNA/ORF クローンライブラリー
最新の研究報告やデータベースに由来する遺伝子情報やオントロジー情報を反映した cDNA/ORF クローンのライブラリーをラインナッ
プしています。本ライブラリーは、最先端のバイオインフォマティクスツールを利用して編成されています。
下表を参考にして研究目的に合ったヒト cDNA/ORFクローンライブラリーをご選択ください。
製品
Fully-sequenced
MGC cDNA
Apoptosis
Cell Cycle(Regulation )
Cytokine(Receptor )
Deubiquitinating Enzyme
DNA Damage Response
Druggable Genome
Drug Target
Epigenetics
GPCR
Growth factor
Insulin Receptor Signaling
Ion Channel
Kinase
Membrane Trafficking
Nuclear Receptor
Oxygen Binding
Peptidase
Phosphatase
Plasma Membrane
Protease
Protein Kinase
Serine Protease
Transcription Factor
Transporter
Tyrosine Kinase
Ubiquitin(Conjugation )
Whole genome
Expression
Ready
MGC cDNA*
CCSB Human
ORFeome
Collection
ORFeome
Collaboration
Collection
Human
ORFeome V8 .1
CCSB-Broad
Lentiviral
Library
Precision
LentiORF
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ク ローンコレクション
cDNA/ORF
* 哺乳動物用発現ベクターに cDNA が挿入されています。
Trans-Lentiviral ORF Packaging Kit
ORF 発現レンチウイルスベクター用の安全・高効率パッケージ
ングシステムです。 Packaging mix とレンチウイルスベクター
を HEK293T パッケージング細胞にコトランスフェクションする
Packaging mix
ORF を含む
レンチウイルスベクター
ことによってパッケージングを行います。
特長
◦ 多用途性:第 2または第 3 世代のレンチウイルスベクター
の効率的なパッケージングが可能です。
◦ 卓越したバイオセーフティー:ウイルスゲノムのパッケージ
ングに必要なタンパク質をコードしている遺伝子を5つの
プラスミドに分け、自己複製能を持つ組み換えウイルス
の生じるリスクを低減しています。
◦ 幅広い細胞指向性:非分裂細胞を含む哺乳動物細胞に
Packaging mix および ORF を含む
レンチウイルスベクターを HEK293T
パッケージング細胞に導入
in vitro およびin vivo において効率的に形質導入するレ
ンチウイルス粒子を作成します。
◦ 高力価: 1 ∼ 5 × 10 6 TU/mL の力価が得られます。
キット内容
自己複製能のないウイルス
◦ Trans-Lentiviral Packaging Mix
◦ HEK293T Packaging Cell
◦ CaCI 2 Reagent
◦ 2X HBSS reagent
◦ Precision LentiORF RFP control DNA
Trans-Lentiviral ORF packaging Kit による
ウイルスパッケージング
14
製品検索方法のご案内
弊社 Dharmacon 専用 Web サイト
dharmacon.gelifesciences.com
へアクセスしてください。
Step 1
ターゲット遺伝子情報を入力してください。
ターゲット遺伝子の Genbank accession number、
gene symbol、gene ID のいずれかを、Web サイト
の上部にある検索窓(赤枠)に入力して検索ボタンを
クリックしてください。
➡
Step 2
製品群ごとに検索結果をまとめてお知らせ
します。
画面は「BRCA1」と入力して検索した結果が表示さ
れた状態です。製品ならびに関連する学術情報が
「遺伝子」のフィールドに表示されます。cDNA/ORF
あるいは shRNA のリンク(赤枠)から各製品リストの
ページに移動してください。
➡
Step 3
関心のある製品についてさらに詳細な製品
リストが表示されます。
画面は Step2で shRNA のリンクをクリックした結果
が表示された状態です。各種デザイン済み shRNA
発現ベクターの+
(赤枠)をクリックすると、さらに詳
細な製品リストが表示されます。
Dharmacon日本語 Webサイトはこちら
www.gelifesciences.co.jp/dharmacon
15
■製品技術情報に関して
FAQ(製品 Q&A)
弊社 Web サイト ▲ サポート
▲ FAQ(製品
FAQ
または、
Q&A)
検索
製品マニュアル
弊社 Web サイト ▲ サポート
▲ 製品マニュアル
バイオダイレクトライン
(営業日の 9:00 ∼ 17:30)
応答メッセージが聞こえましたら、下記の番号を押してください。
クロマトグラフィー関連製品 : 1
:3
ビアコア関連製品
:2
ワットマン製品、その他製品 : 4
電気泳動関連製品
(常時受付)
(常時受付)
基礎学習などに
研究者向けコミュニティ Life Sciences Academy
▲▲
lifesciences-ac.com
■機器アフターサービス
■納期/在庫お問合せ
注)お問合せに際してお客さまよりいただいた情報は、お客さまへの回答、弊社サービスの向上、弊社からのご連絡のために利用させて
いただく場合があります。
注)アナログ回線等で番号選択ができない場合はそのままお待ちください。オペレーターにつながります。
掲載されている価格は 2015 年 7 月現在の希望小売価格です(消費税は含まれておりません)。希望小売価格は単なる参考価格であり、弊社販売代理店が自主的に設定する販売価格を何ら拘束するもの
ではありません。掲載されている製品は試験研究用以外には使用しないでください。掲載されている内容は予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承ください。掲載されている社名や製
品名は、
各社の商標または登録商標です。お問合せに際してお客さまよりいただいた情報は、お客さまへの回答、弊社サービスの向上、弊社からのご連絡のために利用させていただく場合があります。
Life Sciences Academy はゼネラル・エレクトリック・カンパニイまたはその関連会社の商標です。
販売元・問合せ窓口
製造元
フナコシ株式会社
受託・特注品業務担当
TEL:03-5684-1645 Fax:03-5684-6539
E-mail:[email protected]
8
71-3770-02