新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣共同利用・共同研究報告書 C57BL/6ES 細胞を用いた相同組換えクローンの樹立赤間智也 1）、崎村建司 2） 1）関西医科大学薬理学講座、2）新潟大学脳研究所細胞神経生物学分野研究要旨ケラタン硫酸プロテオグリカン(KS-PG)は角膜や軟骨、脳などの組織に検出される糖タンパク質である。申請者らは KS-PG の糖鎖部分であるケラタン硫酸グリコサミノグリカン(KS-GAG)の生合成経路の研究を進めており、生体内における KS-GAG の生物学的機能を解析するため、KS-GAG 合成にかかわる糖転移酵素遺伝子である B3gnt7 のノックアウトマウスを作成してその表現型、特に角膜や脳組織構築に与える影響を解析することを計画した。申請者らは B3gnt7 を全身性あるいは組織特異的にノックアウトできるように構築したコンディショナルノックアウト用のベクターを作成し、実験用マウスとして標準とされている C57BL/6 の ES 細胞に導入して相同組換え体を得た。さらにこれを桑実胚に導入してキメラマウスを作成した。現在ヘテロ接合体マウスの作成を行なっている。 A.研究目的 B.研究方法 KS-PG は角膜や軟骨、脳などの組織に検出される糖始めに申請者らは KS-GAG 生合成に必須な糖転移タンパク質であり、角膜では角膜実質組織の高透明酵素遺伝子である B3gnt7 を含む C57BL/6 マウス度と高屈折率を維持するのに重要な機能を示してい BAC クローンを入手し、この BAC クローンの B3gnt7 ると考えられている。一方で脊髄損傷などの神経切上にネオマイシン耐性遺伝子カセットや loxP 配列、断が生じた時に損傷治癒に伴って KS-PG を含む糖 FRT 配列を recombineering を用いた方法で導入した。タンパク質が産生されて蓄積し、この糖タンパク質の次にこの改変 B3gnt7 を含む DNA 断片を上記の方法蓄積が神経細胞の伸展を阻害するため元通りの軸でプラスミド DNA に回収しこれをノックアウトベクター索再生が行われないことが実験的に示されおり、神とした。このノックアウトベクターを電気穿孔法にて経回路再編への KS-PG の関与が示唆されている。 C57BL/6 由来の ES 細胞に導入し、相同組換えにて申請者らは KS-PG の糖鎖部分である KS-GAG の生生じた変異 ES 細胞を抗生物質による選択とサザンブ合成経路の研究を進めており、これまでに KS-GAG ロッティングによる確認で同定した。こうしてクローン合成に必須と考えられる糖転移酵素、糖鎖修飾酵素化した変異 ES 細胞をマウス桑実胚に注入、凝集させを同定してきた。本共同研究では生体内におけるることでキメラマウスを作成した。なお本共同研究は KS-GAG の生物学的機能を解析することを目的とし、関西医科大学実験動物委員会にて承認されている。 KS-GAG 合成にかかわる酵素のノックアウトマウスを作成してその表現型、特に角膜や脳組織構築に与 C.研究結果える影響を調べることを計画した。ノックアウトベクター導入後の抗生物質による選択で 107 個の抗生物質耐性 ES クローンを得た。このクローン化した ES 細胞からそれぞれゲノム DNA を調製して制限酵素で切断し、サザンブロット法にて相同組換え体を確認したところ 3 クローンの変異 ES 細胞株を得た。このうち 2 つの変異 ES 細胞を野生型マウスの桑実胚に導入することで一つのクローンからは 2 匹、もう一つのクローンからは 12 匹の高キメラ率マウスを得た。現在 C57BL/6 野生型マウスとの掛け合わせを行なっている。 D.考察 ES 細胞のスクリーニングにおいて相同組換え体の割合は薬剤耐性クローン中の約 3%と一般的な値であった。しかしながらそれぞれの相同組換え ES クローンから得られたキメラマウスは ES 細胞の寄与率が 50% からほぼ 100%と非常に高いものであった。マウスにおける ES 細胞の寄与率が高ければ gernline transmission の割合も高いと考えられるので、高キメラ率のマウスからはヘテロ接合体の仔マウスが生まれる可能性が非常に高いものと思われる。 E.結論 C57BL/6 由来 ES 細胞を用いてコンディショナルノックアウトマウスを作成するべくノックアウトベクターを構築し、これを ES 細胞に導入することで相同組換え体 ES 細胞を作成した。さらにはこの ES 細胞由来のキメラマウスの作成に成功した。これらを用いることで B3gnt7 ノックアウトマウスを作成出来、今後の研究に用いることができるものと考えている。 F.研究発表 1.論文発表なし 2.学会発表なし G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む） 1.特許取得未定 2.実用新案登録未定 3.その他未定