2P076 DNA 含有ベシクル型人工細胞の変形様式と 膜中 DNA-触媒分子複合体の局在モードとの相関 (1 東大院･総合、2 岡崎統合バイオ、3 分子研、4 東大･複雑系生命システム研究センター、5 神大･理) ○松尾 宗征 1、栗原 顕輔 2,3、豊田 太郎 1,4、菅原 正 4,5 Correlation between GV-deformation pattern and localization mode of DNA-catalyst complexes in the membrane of GV-based protocell (1The University of Tokyo, 2Okazaki Institute for Integrative Bioscience, 3Institute for Molecular Science, 4Research Center for Complex System Biology, 5Kanagawa University University.) 1 2,3 1,4 Muneyuki MATSUO , Kensuke KURIHARA , Taro TOYOTA , Tadashi SUGAWARA4,5. 背景･目的 近年､「生命とは何か」という命題に対し ､ 「生命とは何か」という命題に対し､ この研究では この研究では､膜分子前駆体を添加すると、 両親媒性分子からなる閉じた二分子膜のジャ 媒性分子からなる閉じた二分子膜のジャ DNA を増幅したベシクルの方が､増幅してい イアントベシクル(GV)で細胞の生体膜を模倣 (GV)で細胞の生体膜を模倣 ないベシクルよりも､より迅速に分裂すること し､人工細胞を構築する研究が行われている。 が見出された。これは ､ ポリアニオンである 我々のグループは､膜分子前駆体 我々のグループは､ 膜分子前駆体 V＊を取り込 DNA とイミダゾール塩酸塩骨格をもつカチ み､構成分子 V へと変換し､肥大･分裂する GV オン性両親媒性分子 オン性両親媒性分子（触媒分子 （触媒分子 C）との間に静 自己生産系を報告した[1]。さらに､V からなる 電的な引力がはたらき､ベシクル膜内で局所的 GV の膜組成に､2 種類のリン脂質（1-パルミト に複合体が形成され、この DNA-触媒分子 C イル-2- オレオイル -3-sn- ホスファチジルコリ 複合体が膜分子前駆体を分解するより強力な ン； POPC と 1- パルミトイル -2- オレオイル 触媒として機能することが要因と考えられる。 -3-sn-ホスファチジルグリセロール;POPG）を 加えたハイブリッド GV を用い ､ その内部で そこで､本研究では DNA-触媒分子 C 複合体 DNA を増幅させることで を増幅させることで､GV の自己生産系 が人工細胞の形態変化に及ぼす影響を明らか と DNA の複製系とが化学的に連動した の複製系とが化学的に連動した GV にすることを目的とした。まず、形態変化時の 型人工細胞系を実現した[2]。 DNA-C 複合体の状態が変化することを期待し、 複合体の状態が変化することを期待し、 DNA 増幅後から膜分子前駆体添加までの時間 V＊(膜分子前駆体) 加水分解 C(触媒分子) H2N O E(電解質) C C PCR DNA 複製 図1 で観測した。 C C C 次に、蛍光分子間で生じる励起エネルギー移動 蛍光分子間で生じる励起エネルギー移動 DNA-C 複合体形成の進行度合い 複合体形成の進行度合いを蛍光顕微鏡 を蛍光顕微鏡 C C しく変化する新奇人工細胞の構築を目指した。 を利用し、形態変化前の人工細胞における を利用し 、形態変化前の人工細胞における N Br V(膜分子) を変化させ、膜分子添加後のダイナミクスが著 V 添加 C ＊ C GV 自己生産 GV 型人工細胞の構成分子と概略図 [1] K. Takakura, et al., Langmuir, 20(10), 3832–3834 (2004) [2] K. Kurihara, et al., Nat.Chem., 3, 775–781(2011) 実験･結果 POPC：POPG：V：C：コレステロール＝35： た後の人工細胞について、 た後の人工細胞について、①BODIPY ①BODIPY のみを 39：12：9：5 を膜組成として、1164bp の DNA 励起･検出、②Texas Red のみを励起･検出、お と DNA ポリメラーゼおよび PCR（ポリメラー よび③BODIPY よび③BODIPY を励起し TexasRed を検出する ゼ連鎖反応）試薬を内包する人工細胞を凍結融 それぞれの観測条件で蛍光観察したところ、 それぞれの観測条件で蛍光観察したところ、 解法で作製した。この人工細胞は、PCR で DNA ①②のみならず ①②のみならず ③ の条件でもこの人工細胞は を増幅した直後に V*を添加すると､先行研究 Texas Red の強い蛍光を発した。 の強い蛍光を発した。DNA DNA 増幅後 と同様の Budding 変形を高い頻度で 変形を高い頻度で起こした 起こした の静置時間を変えて、③の条件で撮影した顕微 （図 2a）が､DNA 増幅後の静置時間の増加に 鏡像から励起エネルギー移動に基づく 鏡像から励起エネルギー移動に基づく Texas 伴い、Budding 変形の割合は減少し、人工細胞 Red の蛍光輝度を測定したところ、静置時間の が球形から全方向に複数のチューブ状ベシク 経過に伴い輝度が増大することがわかった 経過に伴い輝度が増大することがわかった。以 ルを伸⻑させた形状に変形 （ Multi-tubulation 上より、蛍光プローブを担持させた DNA と触 変形、図 2b）する割合が増加した。 媒分子 C が近接していることが明らかになっ a）Budding 変形 たが、DNA-C 複合体形成の有無に関わらず、 DNA が膜表面に吸着するだけでも励起エネル ギー移動は起こる可能性がある。そこで、人工 細胞の内水相と外水相に、Texas Red の水溶性 ｂ）Multi-tubulation 変形 消光剤である TEMPOL を溶解させ、蛍光観察 を先と同様に行った。その結果、③の条件で観 察された TexasRed の蛍光輝度は の蛍光輝度はあまり あまり消光剤 の影響を受けなかった。これにより、GV 膜内 図2 人工細胞の 2 つの変形パターン 一方、試験管内で PCR により増幅した DNA 部に DNA が侵入していることが が侵入していることが示された 示された。 総括 に上記の組成で脂質を混合し､形成した脂質凝 以上の実験結果から､DNA-触媒分子 C 複合 以上の実験結果から､DNA 集体に V*を添加すると、一つの脂質凝集体か 体形成の進行に伴い､膜分子前駆体添加後の らチューブ 状ベシクルが多数生成することが らチューブ状ベシクル が多数生成することが GV 型人工細胞の変形パターンが変わることが 観察された。この結果は､DNA 観察された。この結果は､ DNA-触媒分子 C 複 強く示唆された 強く示唆された。本研究において､PCR 後静置 合体形成の進行が Multi-tubulation 変形を誘発 時間が短い場合、複合体形成があまり進行せず､ していることを示唆している。 膜分子生産が穏やか 膜分子生産が穏やかに行われ､人工細胞が熱力 に行われ､人工細胞が熱力 次に､触媒分子 C にドナーとなる BODIPY 学的に安定な曲率を維持しながら変形すると を、DNA のプライマーにアクセプターとなる 考えられる。一方で 考えられる。一方で､PCR 後静置時間が⻑い場 Texas Red をそれぞれ担持させ、上記の膜組成 合は､急速に膜分子が生産されるため､自発曲 は､急速に膜分子が生産されるため､自発曲 で人工細胞を調製した。これらの蛍光プローブ 率を維持できず､速度論的変形として 分子が約 5 nm 以内の近接状態にあるときに生 Muti-tubulation が誘発されると考えられる。 じる BODIPY の励起エネルギー移動に基づく これらの結果は､DNA が膜分子と相互作用 Texas Red の蛍光を共焦点レーザー走査型蛍光 することで酵素のように振る舞うことを示し 顕微鏡で観測した。PCR により DNA を増幅し ており､生命起源研究の観点からも興味深い。
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![平成 27 年 5 月 14 日 [神戸大学大学院農学研究科] 李智博准教授が](http://s1.expydoc.com/store/data/006070707_1-3e6fd1585bf925076db6363e411c729d-250x500.png)
