平成 25 年度大学技術委託研修と畜検査における分子生物学的検査

平成 25 年度大学技術委託研修
と畜検査における分子生物学的検査手法の応用
（ホルマリン・パラフィン包埋組織による分子遺伝学的腫瘍検査の有効性）
熊谷光
１はじめに
今回の研修では分子生物学的手法を用いた腫瘍
．．
と畜検査において、がんや白血病などの腫瘍病
診断法を研究する目的で、動物種として牛を、病
変は判定が難しい疾病のひとつである。その理由
変としては腫瘍の中でも発生頻度が高い牛白血病
としては、肉眼のみでの判断が困難なこと、腫瘍
を対象に、p53 遺伝子について解析した。なお、
の分布や悪性度により廃棄基準が異なること、腫
被検材料については、研修期間内に検体数を確保
瘍の種類によって病態の傾向が異なることなどが
する目的から、過去に当所で発生、診断後、保管
挙げられる。腫瘍診断は細胞診や病理組織学的検
していたホルマリン固定・パラフィン包埋
（以下、
査が必須な検査法であるが、腫瘍細胞を形態学的
FFPE）組織を用いた。このため、FFPE 組織か
に診断する必要があるなど経験と知識が必要とさ
らの DNA 抽出方法についても併せて検討した。
れ、簡易な検査法ではない。そのため、これら検
査法の他に比較的判別がしやすい検査法が望まれ
ている。
．．
医学領域では、既に多くの腫瘍について、がん
．．
遺伝子やがん抑制遺伝子の変異などの解析が行わ
２方法と結果
研究を行うにあたり、解析する遺伝子領域につ
いてヒトの事例を参照に検討した。ヒトの p53 遺
伝子データベース（http://p53. free.fr/）や各報告
p53 遺伝子突
れている。
また、
遺伝子突然変異の状況などから、
9),11),23)によると、腫瘍病変における
その結果を基にした悪性度の診断についても研究
然変異の多くは点突然変異であり、変異の多くは
されている 25)。なかでも、がん抑制遺伝子のひと
コアドメインである DNA 結合ドメイン（以下、
つである p53 遺伝子については、多くの腫瘍で突
DBD）に集中している。DBD には特に変異の発
2),6)、ゲノム解析を含め
生頻度が高いアミノ酸部位が 6 カ所存在し、これ
然変異が認められており
て数多くの研究が報告され全世界的にデータベー
らは変異ホットスポットと呼ばれている（図 1）。
ス化されている 9),12),14),19),23)。
一方、牛 p53 遺伝子の DBD については、アミノ
p53 遺伝子のゲノム解析は多くの動物種におい
酸配列はヒトとの相同性が高く、6 ヶ所のホット
ても行われており、哺乳動物はヒトと相同性が高
スポットも同様のアミノ酸からなることが報告さ
いゲノムを有していることが知られている
17),18)。
れている 3),15),22)。
このため、ヒトの手法を応用した p53 遺伝子の腫
これらのことから、今回の研究ではヒトのホッ
瘍診断法が動物で活用できる可能性は高い。しか
トスポットで牛に該当する部位、即ち exon5 のコ
しながら、哺乳動物の腫瘍病変における p53 遺伝
ドン 167（以下、R167）
、exon7 のコドン 241（以
子解析の報告は少ないため、ヒトと同様の遺伝子
下、R241）
、exon8 のコドン 266（以下、R266）
変異が生じているかは不明であり、検査方法を検
の各周辺領域を解析対象とした。研究の流れは、
討する前にデータを蓄積していく必要がある。
大きく以下に示す三段階となっている。
図 1 ヒトのがんにおける p53 遺伝子のコドン別変異
発生率。数字は 6 つのホットスポットコドンを示す
（http://p53.free.fr/より引用、一部加筆）。
図 2 p53 解析領域の PCR 条件
(1)ゲノム PCR による解析領域増幅法の確立
対象領域を増幅する PCR 法について検討した。
(2)FFPE 組織からの DNA 抽出法の検討
健康な牛 5 頭（ホルスタイン種、黒毛和種）より
実験(1)で確立した PCR 法を行い、FFPE から
皮膚を採取し、DNeasyⓇ Blood＆Tissue Kit（キ
の様々な DNA 抽出法について検討した。主な抽
アゲン社、以下、DNeasy）を用いて DNA を抽出
出方法としてはキシレン、エタノールによる脱パ
した。この抽出 DNA 溶液を鋳型とし、図 2 に示
ラフィン操作後に DNeasy を用いて抽出する方法
す条件により PCR 法を設計した。
と、TaKaRa DEXPATⓇ（タカラバイオ株式会社、
PCR 産物はアガロースゲル電気泳動し、特異的
以下、DEXPAT）により FFPE から直接抽出する
な増幅産物のバンドを確認した。この増幅産物を
方法を選択した。被検材料は、実験(1)で使用した
切り出し、MinEluteTM Gel Extraction Kit（キ
牛皮膚組織を 10％中性緩衝ホルマリンで 24 時間
アゲン社）で精製した後、プラスミドベクターに
固定後、定法に従い FFPE を作成した（以下、皮
TA ライゲーションしクローンを作成した（TOPO
膚 FFPE）5 検体と、当所で過去に発生した牛白
TA CloningⓇ KIT、
並びに One SHOTⓇ TOP10、
血病の FFPE 組織（以下、BL-FFPE）10 検体と
いずれもライフテクノロジー社）
。
このクローンを
した（表 1）
。
ローリングサイクル型増幅法（TempliPhi DNA
Amplification Kit、GE ヘルスケア社、以下、RCA
法）にて増幅し、ダイターミネーター法によるサ
イクルシークエンス反応（BigDyeⓇ Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Kit、ライフテクノロジー
社）
、ゲル濾過（Sephadex G-50、GE ヘルスケア
社）を実施した後、シークエンサー（Applied
Biosystems 3500 ジェネティックアナライザ、ラ
イフテクノロジー社）
により塩基配列を決定した。
得られた結果については、BLAST 解析により
既知の牛野生型 p53 遺伝子と比較した。
その結果、
目的の領域が PCR 反応で増幅されていることを
確認した。
表 1 被検対象 BL-FFPE 一覧
各 FFPE はミクロトームを用いて 6~10μm に
薄切し、なるべく腫瘍組織のみとなるよう
5~10mm×5~10mm の大きさにトリミングした。
表 3 BL-FFPE の p53 遺伝子変異（変異の有無）
領域
サンプル№
R167
R241
R266
各手法で抽出した DNA 溶液はエタノール沈殿に
BL2
-
+
-
より 10 倍に濃縮し、これを鋳型に PCR を行い、
BL3
-
-
NT
BL4
-
-
NT
BL5
+
-
BL6
-
+
+
BL7
-
NT
-
BL8
-
-
-
検体が複数認められ安定した成績が得られなかっ
BL9
-
-
-
た。そこで、BL-FFPE の一部の検体について表 2
BL10
-
-
-
に示す手法を追加して抽出方法の改善を行い、再
BL11
NT
-
+
アガロースゲル電気泳動にて特異的増幅産物の有
無を確認した。
この結果、皮膚 FFPE では両手法とも安定した
成績が得られたが、BL-FFPE では再現性がない
度 PCR 反応にて増幅産物を確認した。追加手技
-
NT：PCRによる特異増幅認めず
①、③では PCR 反応に改善は認められず有効性
が確認されなかったが、手技②において成績が安
表 4 BL-FFPE の p53 遺伝子変異（詳細）
定したため、この手法を FFPE からの標準 DNA
抽出法に設定した。
変異
サンプル№
表 2 改善抽出法の一覧
問題点改善のため追加手技
（予想される問題点）
①
Whole genome amplification
（WGA）法※１
（ＤＮＡ量が少ない）
②
脱パラフィン操作におけるキシ
※2
レン、エタノール工程の追加
（抽出液の夾雑物混入による
PCR反応阻害）
③
ホウ酸緩衝液（pH9.0）・熱処理
※3
法
（ホルマリンのDNA化学修飾
によるPCR反応阻害）
※1　GenomiPhi DNA Amplification Kit（ライフテクノロジー社）による
※2　DNeasy検体のみ実施
※3　Shi、Tagaらの方法を参照16）、20）
コドン
ヌクレオチド
アミノ酸変異
ヒトの対応
コドン
BL2
238
GGC→GAC
Gly→Asp
245
BL5
167
CGT→CAT
Arg→His
175
〃
253
AGA→AAA
Arg→Lys
260
BL6
249
ACA→GCA
Thr→Ala
256
BL11
263
TTT→TTC
Silent
270
〃
275
CGC→CAC
Arg→His
282
1 塩基置換によるアミノ酸配列変異（ミスセンス
変異）、1 ヶ所がアミノ酸配列変異を伴わない変異
（サイレント変異）であった。ヒトのホットスポ
ットに該当するコドンでの変異は、コドン 167、
(3)BL-FFPE 抽出 p53 遺伝子の解析
238、275 の 3 ヶ所で認められた（表 3、4）
。
表 1 に示した BL-FFPE10 検体について、実験
(2)の標準法により DNA を抽出後、実験(1)で確立
３考察
した PCR により、各特定領域を増幅した。増幅
FFPE は本来病理組織学的検査で使用するもの
産物については、実験(1)と同様の方法によりサブ
であるが、Goelz らによって DNA を抽出可能で
クローニングと RCA 法による増幅後にシークエ
あることが報告され 5)、近年は分子生物学的研究
ンスを実施した。得られた塩基配列は牛野生型
サンプルとしても活用されている。ただし、FFPE
p53 遺伝子と比較し、変異の有無や、変異の詳細
組織から抽出された DNA はホルマリン固定によ
を確認した。
り断片化されるため、PCR を行う場合は増幅産物
結果、変異は 10 検体中 4 検体、30 領域中 6 ヶ
所で確認された。変異の内訳は 6 ヶ所中 5 ヶ所が
のサイズを 100~200bp にすることが推奨されて
いる
13) 。よって、今回の研究では増幅産物が
100bp 弱となるよう PCR 条件を新たに設計し、
以上がミスセンス変異であり、このことが p53 変
牛皮膚の生検体及び皮膚 FFPE を用いた試験で良
異の特徴といわれている 10)。本研究の結果、ミス
好な成績を得た。
センス変異は 83.3％と高い割合で、ヒトと同様で
一方、研究当初、複数の BL-FFPE 検体で PCR
あった。このように、牛白血病における p53 遺伝
の成績が安定しなかった。この理由として、DNA
子変異は高率に認められること、ミスセンス変異
量が少ないこと、夾雑物が混入していること、
の割合が高いこと、特定のコドンで変異が確認さ
DNA がホルマリンによる化学修飾を受けている
れることなど、ヒトと同様の結果が得られた。従
ことが考えられたため、これらの改善方法を検討
って、牛における p53 遺伝子変異の検査に、ヒト
した。結果、脱パラフィン操作を徹底することで
の方法を活用することは可能であることが示唆さ
改善効果が認められたことから、夾雑物混入によ
れた。一方で、ヒトでの報告が少ないアミノ酸変
る PCR 阻害が原因と疑われた。検体として用い
異も 2 例確認された。ヒト腫瘍の p53 データベー
た BL-FFPE については作成方法などの詳細な記
スでは多種のアミノ酸変異が報告されており、希
録が残っていないが、再生パラフィン使用や、過
な症例とは判断しにくいが、牛白血病における特
剰なパラフィン含有による夾雑物が抽出液に持ち
異的な変異である可能性も考えられる。現状にお
越された可能性が高い。しかしながら、このよう
いては異なる二つの考察が導き出されていること
な操作の改善によっても PCR による特異的増幅
から、より多くの症例について解析しデータを蓄
が認められない検体が、10 検体中 4 検体（30 領
積したうえで、変異の特徴を考察していく必要が
域中 4 領域）と高率で認められた。特異的増幅が
あると考える。なお、解析結果を基にした具体的
認められない領域に偏りはなく、また、検体の保
な腫瘍診断法としては、今回変異が認められた領
存年限にも関係性が認められなかったため、原因
域をプローブしたハイブリダイゼーション法が比
としては、当該検体の DNA が断片化しているこ
較的簡易で有効な方法と考えられることから、今
とが推察された。追加試験した WGA 法は抽出し
後の研究課題としたい。
た DNA を偏りなく増幅することが可能で、特に
DNA 量が少ない場合に有効であることが報告さ
稿を終えるにあたり、本研修でご指導いただき
れている 7)が、今回の研究では有効でなかったこ
ました石巻専修大学生物科学科阿部知顕教
と、また、ホウ酸緩衝液・熱処理法でも改善を認
授、シークエンシングなど研究にご協力いただき
めなかったことも、DNA 断片化の可能性が高い
ました同大学食環境学科柴田清孝教授、
ことを裏付けている。なお、近年、FFPE 組織か
並びに、同大学の諸兄に深謝いたします。
ら DNA 抽出する改良 WGA 法も報告されている
1),24)ことから、これらの方法についても検討する
（引用文献）
必要があると考えられる。
1)
過去に牛白血病の p53 変異を調査した他の報告
Arneson N, Moreno J, Iakovlev V, Ghazani A,
Warren K, McCready D, Jurisica I, Done SJ:
では、変異の割合は約 50％であり、ヒトのホット
Comparison
スポットであるコドン 248 に該当するコドン 241
methods for analysis of DNA extracted from
で高頻度に変異が確認されている
4),8),21),22)。今回
of
microdissected
Whole
early
Genome
breast
Amplification
lesions
in
の研究では変異発生率は 40％で、コドン 241 の
formalin-fixed paraffin-embedded tissue, ISRN
変異は確認されなかったがコドン 167、238、275
Oncol Volume 2012, 1-10(2012)
と他のホットスポットに該当するコドンで変異が
2)
Béroud C, Soussi T:The UMD-p53 database: new
観察されており、他の報告と同様の結果と考えら
mutations
and
analysis
れた。また、ヒトでは p53 遺伝子変異のうち 75％
21(3),176-181(2003)
tools.
Hum
Mutat,
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