精子無力症の原因となる遺伝子 変異検出方法の開発 独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター 招聘研究員 髙﨑延佳 センター長 成松 久 1 O-結合型糖鎖合成における pp-GalNAc-Tの役割 pp-GalNAc -T3 Catalytic domain Gal/GalNAc-T motif pp-GalNAc-T3 TM Ricin-like Lectin motif GT1 motif 633aa Stem ピークの移動が酵素活性をします GFP-pp-GalNAc-T3 DAPI cis-Golgi Merge 基質 pp-GalNAc-T3タンパク質はゴルジ体に局在 3 ヒトpp-GalNAc-T遺伝子ファミリー Previously known genes Genes identified in NEDO GG project ID Length aa T1 559 T2 571 T3 633 T4 578 T5 940 T6 622 T7 657 T8 637 T9 603 T10 (O9) 603 T11 608 T12 (O12) 581 T13 (O17) 556 T14 (O8) 552 T15 (O14) 639 542 O11 575 O6 598 O18 607 443 O16 O21 601 NCBI Est NM_020474 NM_004481 NM_004482 NM_003774 NM_014568 BC035822 BC047468 NM_017417 AB040672 NM_198321 NM_022087 AJ132365 NM_052917 AY358758 AB078149 (-) NCBI genome NT_010966 NT_004559 NT_005403 NT_019546 NT_005403 NT_029419 NT_022792 NT_009759 NT_086797 NT_029289 NT_007914 NT_008470 NT_005403 NT_022184 NT_086636 chr. Exons Mutation 18q12.1 12 1q41-q42 16 2q24-q31 10 Q465R 12q21.3-q22 1 2q24.1 10 12q13 10 4q31.1 12 12q13.3 11 W299R 12q24.3 11 5q33.2 12 7q34-q36 10 M551V，Q577L 9q31.1 10 2q24.1 11 F4S 2p23.2 15 3p25.1 10 NT_026437 14q24.1 14 NT_007758 NT_086780 NT_086733 NT_086656 7q11.23 11p15.3 7q36.1 4 11 11 9 12 Authors White T, Clausen H White T, Clausen H Bennett EP, Clausen H Bennett EP, Clausen H Ten Hagen et al. Bennett EP, Clausen H Bennett EP, Clausen H White KE, Econs MJ Toba S, Kurosaka A Cheng L, Narimatsu H Schwientek T, Clausen H Guo J-M, Narimatsu H Zhang Y, Narimatsu H Wang H, Narimatsu H Cheng L, Narimatsu H Y321N，R424T Nakamura N, Kurosaka A Catalytic domain O-16 (GALNTL5) TM Stem GT1 motif Gal/GalNAc-T motif 443aa Ricin-like lectin motif pp-GalNAc-T3 633aa 4 0 LC-11N DK-9N Thymus Spleen Bone marrow Small intestine Thyroid Adrenal gland Pancreas Mammary gland Prostate 精巣 Placenta Fetal liver Spinal cord Salivary gland Cerebellum Fetal brain Heart a 80 Kidney O-16はin vitrioでは酵素活性を示さない Uterus Skeletal muscle Liver Brain whole Trachea O-16/GAPDH (×10-4) O-16 (GALNTL5) の酵素活性 組織特異的なヒトO-16遺伝子の発現 ヒト組織でのreal-time PCRの結果 70 60 50 40 30 20 10 基質 5 マウスO-16相同遺伝子の精巣内での発現様式 a b x4 c x4 x40 mO-16 sense mO-16 anti-sense d マウス精子形成過程の図 mO-16 anti-sense マウスにおいて、O-16遺伝子は減数分裂後 の精子細胞のみで発現しており、精原細胞、 精母細胞、体細胞であるセルトリ細胞では発 現していない。 6 精子細胞内でのO-16タンパク質の局在 a b c III VI VIII O-16タンパク質は精子細胞の細胞質に局在し、ゴルジ体には存在しない f e d g 先体 DAPI PNA O-16 Merge 成熟精子において、O-16タンパク質は精子尾部中間部に弱く存在する一方で、頚部部分に強く局在する 核 O-16 distributes in the cytoplasm of spermatids during spermiogenesis. 7 O-16タンパク質は精子形成過程のみで機能する Acrosome biogenesis Migration and involution of Golgi apparatus O-16 protein distributes in the cytoplasm of spermatids Acrosome Flagellum Ramalho-Sabtos et al., 2002 Biology and Reproduction Golgi apparatus Moreno et al., 2000 Biology and Reproduction 8 O-16遺伝子へテロ欠損マウスの樹立 b a H A Normal Allele P 6605A 5970S P H 3ʼ 5ʼ Wt Ht Wt Ht Ht Wt 3 2 1 c Neo TK 50 37 3.4 kb 6.0 kb S Targeted Allele 5ʼ 3ʼ Neo 50 1 kbp Fertility (%) 120 NeoLeft25 O-16 25 0.7 kb probe d (kDa) 250 150 100 75 4.4 kb S Targeting Vector Wt Ht α-tubulin AvrHind2-2 ヘテロ遺伝子欠損による雄性不妊 f Ht e Wt g Abnormal rate (%) 60 100 50 80 40 60 30 40 20 20 0 wt male Wt male (n=8) (n=8) ht male ht female female Ht male Ht (n=16) (n=15) (n=16) (n=15) Arrows indicate deformed or ventral flexuous sperm from Ht males. 10 0 wt Wt ht Ht 9 O-16遺伝子ヘテロ欠損は精子運動能の障害を引き起こす Wt Ht (%) Motility 60 50 40 30 20 10 0 wt ht Wt Ht 精巣精子を使った顕微授精実験 Male Ht Wt Female Wt Wt No. embryos transferred 76 43 No. (%) embryos implanted 45 (59) 27 (63) No. (%) pups born 23 (30) 14 (33) There were no statistical differences in the rates of implantation or normal birth between the experimental groups (P > 0.05, Fisher's exact test). 10 マウス精子の運動に関わる酵素タンパク質の比較 精子特異的運動エネルギーを産生する解糖系タンパク質 Hexokinase (HXK) wt ht wt ht wt ht wt ht wt ht (kDa) 250 6-phosphofructokinase type C (PFKP) Fructose-bisphosphate aldolase A (ALDOA) 150 250 150 100 100 250 75 150 75 50 37 Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) (kDa) 50 wt ht 100 75 50 37 37 Phosphoglycerate mutase 2 (PGAM2) 25 Silver staining HXK PGK2 ALDOA α-tubulin 25 25 O-16 Cao et al., 2006 Molecular & Cellular Proteomics 11 Wt Ht ヘテロ遺伝子欠損マウス精子におけるユビキチ ンプロテアソームタンパク質の異所的な局在 Wt Merge Ubiquitin Ht Merge HXK HXK Merge Merge Ubiquitin UBC3B (ubiquitin- UBC3B UBC3B (%) conjugating 60 enzyme E2) 50 Motility 40 30 20 10 0 DAPI DAPI wt ht Ht Wt 12 ヘテロ遺伝子欠損マウス精子における先体タンパク質の減少 Wt Ubiquitin Ht Wt Acrosin Ht Wt tACE Merge Merge Merge Merge Merge Merge Ubiquitin Ubiquitin Acrosin Acrosin tACE tACE DAPI DAPI DAPI DAPI DAPI DAPI PNA PNA PNA PNA PNA PNA Ht 13 マウス精巣および精子における先体タンパク質の動向 培養細胞内でのO-16タンパク質の局在 O-16 Moreno et al., 2000 Biology and Reproduction GFP-O-16 精巣 Wt Ht Wt Ht 精子 Wt Ht Wt Ht Wt Ht (kDa) Wt Ht Wt Ht (kDa) 250 150 100 250 150 100 75 75 50 50 37 37 25 α-tubulin Wt Ht 25 Ubiquitin Acrosin tACE α-tubulin Ubiquitin Acrosin tACE 14 O-16遺伝子ヘテロ欠損マウスで産生される精子の特徴 Wt Ht (%) Motility 60 50 40 30 20 10 0 マウス精子の運動能障害はヒト男性不妊症の一つである精子無力症の症状と酷似している wt ht wt ht Wt Ht wt ht wt ht wt ht wt ht (kDa) 250 150 100 75 50 37 25 O-16 α-tubulinHXK NSF tACE 15 ヒトO-16遺伝子変異による男性不妊症例の検索 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Volume (mL) 4.9 4.1 4.1 2.4 2.1 6.6 3.6 5 5.5 3 4.4 1.9 2.3 3.9 3 Concentration (×107/mL) 8600 4600 25200 14800 6300 2900 2100 1300 4900 17000 1400 9600 1500 3000 21200 (kDa) 1 2 3 4 5 6 37 Motility (%) 55.8 56.5 68.3 58.1 19 0.3 21.6 28.8 8.2 17.9 50.9 8.3 6.5 16.7 21.4 Morphology (%) 23.1 20.9 22.2 20.9 6.7 7.2 5.6 10.9 1.8 5.2 13.3 5.7 2 5.8 9.5 Diagnosis Normal Normal Normal Normal Asthenozoospermia Asthenozoospermia Asthenozoospermia Asthenozoospermia Astheno/Teratozoospermia Asthenozoospermia Oligozoospermia Astheno/Teratozoospermia Oligo/Astheno/Teratozoospermia Astheno/Teratozoospermia Asthenozoospermia 7 8 9 10 11 12 13 14 15 O-16 100 tACE 75 NSF 100 HXK 50 α-tubulin 16 No. 9の患者症例 M Normal exon 6 sequence Deleted mutation PCR primer deletion stop CCTGATAG // 1 // 2 // 3 // 4 // 5 // 6 // 7 Father // 8 Mother 9 coding region (443 amino acids) ? Patient 9 男性不妊症における生殖補助医療 体外受精 (in vitro fertilization) 顕微授精 (intracytoplasmic sperm injection) 体外受精 顕微授精 17 No. 10の患者症例 Potential number of male germ cells in a clone stop ATGA AT // 1 // 2 // 3 // 4 // 5 // 6 // 7 // 8 9 Point mutation of splice acceptor site coding region (443 amino acids) 5ʼ UTR D 3ʼ UTR 精子からのDNA M 10 11 12 13 14 15 M 10 11 12 13 14 15 Non digestion PstI digestion E 血液からのDNA M 10 11 12 13 14 15 Non digestion M 10 11 12 13 14 15 PstI digestion 18 従来技術とその問題点 日本国内で不妊に悩むカップルの割合は、6 8組に1組の割合にまで上昇しており、男性側 が原因となる男性不妊症のおよそ80%が、精子 の運動能障害 (精子無力症) によることが明ら かになってきています。 しかし、医療現場では精液検査のみで、男性 不妊症の原因を解明すること無く、体外授精な どの生殖補助医療が行なわれているのが現状 です。 19 新技術の特徴・従来技術との比較 • 精子無力症の発症原因となる遺伝子を新た に発見。 • 発症した精子無力症が発見した遺伝子上の 変異に起因しているかを判別する技術を開発。 • 男性不妊症の診断は、精液検査によって精子 の数、運動率、形態異常を観察することで行 われるが、精子に生じている分子異常を調べ る手法等は確立されておらず、また実際に行 われていないのが現状である。 20 想定される用途 • 本技術の特徴は、男性不妊症患者精子を使 用して原因因子を同定する点で患者への負 担が少なく、メリットとして大きいと考えられる。 • 男性不妊症治療薬開発に際しては、開発され た遺伝子改変マウスは有効な生体試料に成 り得る。 • また、遺伝子診断、検査の項目の一つとして、 本遺伝子を利用することは可能である。 21 実用化に向けた課題 • 現在は、一つの特定遺伝子上に生じた変異を 原因とした精子無力症を判断する技術である。 • 今後、他にも多数存在する精子無力症の原 因となる遺伝子変異を簡便に特定する手法を 開発する予定である。 • 実用化に向けて、より多くの精子形成遺伝子 をターゲットにその遺伝子変異を検出できるよ うな技術を確立する必要がある。 22 企業への期待 • 精子タンパク質を対象に、マーカータンパク質 抗体によって検出されるシグナル強度を簡便 に定量化する技術。 • 抗体作成の技術を持つ企業との共同研究を 希望。 • また、病気診断薬を開発中の企業、遺伝子検 査分野への展開を考えている企業には、本技 術の導入が有効と思われる。 23 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称 ：男性不妊症の原因因子検出方法 及び男性不妊症モデル動物 • 出願番号 ：特願2012-033273 • 出願人 ：独立行政法人産業技術総合研究所 独立行政法人理化学研究所 • 発明者 ：髙﨑延佳 成松久 小倉淳郎 持田慶司 24 お問い合わせ先 独立行政法人産業技術総合研究所 ライフサイエンス分野研究企画室 ＴＥＬ 029-862-6032 ＦＡＸ 029-862-6048 e-mail [email protected] 25
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