MAb Pac SEC-1 - Thermo Scientific ホーム

CHROMATOGRAPHY CONSUMABLES
モノクローナル抗体用サイズ排除クロマトグラフィーカラム
Product Specifications
MAbPac SEC-1 カラム
Thermo Scientific™ MAbPac™ SEC-1はサイズ排除クロマ
トグラフィー（SEC ）用カラムで、モノクローナル抗体のモノ
マー、凝集体、フラグメントなどの分離のためにデザインされ
ています。ユニークな固定相には、タンパク質が変性する移動
相や変性しない移動相、高濃度や低濃度の塩、もしくは揮発性
の移動相を使用することが可能です。
製品の特長
・特許取得済みの親水性固定相は、タンパク質と固定相の不要
な相互作用を最小限に抑制します。
・安定した結合相表面はブリードが少ないので、質量分析計、
ELSD、および Thermo Scientific Dionex™ Corona™ 荷電化
粒子検出器で使用可能です。
・堅牢性と再現性に優れています。
・モノクローナル抗体とその凝集体、フラグメントの分離に優
れています。
はじめに
カラムテクノロジー
モノクローナル抗体（mAb ）は、
治療用に
MAbPac SEC-1カラムは、高純度、球状、
広く研究されているタンパク質です。バイ
全多孔性（300 Å ）
、
5 µmシリカに親水性
オ医薬品としての製造承認および製造に
のジオールを結合した充填剤を使用して
際して、純度確認、凝集体やチャージバリ
います。カラムの内径は7.8、
4.0、2.1 mm
アントの分析が規制で要求されています。があり、
それぞれのアプリケーションや注
哺乳動物の細胞培養により生産した mAb
入量に応じてお選びいただけます。7.8 mm
には、
ダイマー（二量体）や多数の凝集体が
内径のカラムは堅牢性に優れているので、
含まれています。サイズ排除クロマトグラ
ルーチン分析で高分離が必要な場合や凝
フィーは、
バイオ医薬品に含まれる凝集体
集体の分離に適しています。4.0 mm内径
の正確な検出と定量に一般的に利用され
のカラムはカラム容量が低いので、
最新の
ています。また、
特性解析および mAb製品
HPLCシステムを使用する場合や、使用す
の品質管理において、
ルーチン分析に利用
る移動相の量を減らしたい場合に適して
されています。
います。2.1 mm内径のカラムは感度よく
分析できるため、
少量サンプルの注入時や
質量分析計による検出に適しています。
アプリケーション
50.0
mAbとそこに含まれる
40.0
培養細胞から生成された mAbには、ダイ
マー、
トリマー（三量体）
とそれ以上の多量体
(a)
30.0
20.0
が含まれています。凝集体の生成は、
特に加
温、
せん断されてひずみが発生した場合、
表
凝集体
10.0
面に吸着したり高濃度であったりした場合
0.0
に起こり、
理由が不明の場合もあります。凝
集体が含まれるバイオ医薬品は、
重篤な免
疫反応やアナフィキラシー性反応を引き起
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 12.5 15.0
18.0
min
図1 a：モノクローナル抗体（mAb ）と凝集体の分析（7 .8 × 300 mm ）
こすといった研究報告もあります。このため
150
バイオ医薬品の製造において、
FDAやその他
各国の規制では、
バイオ医薬品の分析方法
(b)
カラム:
MAbPac SEC-1, 5 µm,
カラムサイズ: 4.0 × 300 mm
移動相:
50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）+300 mM
塩化ナトリウム
流速:
200 µL/min
注入量:
5 µL
カラム温度: 30 ºC
検出:
280 nm
サンプル:
mAb (1 mg/mL)
mAb モノマー
125
および薬効や薬の安全性確認が要求されて
100
mAU
います。図1a、
1b、
1cで示すように、
MAbPac SEC-1は、さまざまな mAbとこれ
カラム:
MAbPac SEC-1, 5 µm,
カラムサイズ: 7.8 × 300 mm
移動相:
50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）+300 mM
塩化ナトリウム
流速:
760 µL/min
注入量:
10 µL
カラム温度: 30 ºC
検出:
280 nm
サンプル:
mAb (1 mg/mL)
mAb モノマー
mAU
凝集体分析
らの凝集体を分析できるようにデザインさ
75
50
れたカラムです。3種類の内径の中で、
凝集体
25
7.8 mm内径のカラムが一番高分離でき、
0
mAbとこれに含まれているダイマーやトリ
マーをベースラインで分離できる可能性が
あります。4.0 mm内径のカラムは、
7.8 mm
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 12.5 15.0
18.0
min
図1 b：モノクローナル抗体（mAb ）と凝集体の分析（4 .0 × 300 mm ）
内径のカラムと比較して分離がやや劣りま
すが、
mAbとこれに含まれるダイマーを分
70.0
離できる可能性があります。2.1 mm内径
60.0
とも分離が劣ります。しかし高感度を得る
ことができ、
貴重な試料の消費を抑制するこ
とが可能です。4.0 mm内径のカラムでは
カラム:
MAbPac SEC-1, 5 µm,
カラムサイズ: 2.1 × 300 mm
移動相:
50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）+300 mM
塩化ナトリウム
流速:
50 µL/min
注入量:
1 µL
カラム温度: 30 ºC
検出:
280 nm
サンプル:
mAb (1 mg/mL)
mAb モノマー
50.0
40.0
30.0
200 µL/minの流速で分析を行い、
2.1 mm内
20.0
径のカラムでは50 µL/minの流速で分析を行
10.0
いました。2.1 mm内径および4.0 mm内径
0.0
のカラムは、
質量分析計による検出にも利用
可能です。
(c)
mAU
のカラムは、
三つの内径のカラムの中でもっ
凝集体
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 12.5 15.0
18.0
min
図1 c：モノクローナル抗体（mAb ）と凝集体の分析（2 .1 × 300 mm ）
mAbのフラグメント分析
100
mAbの完全な分析には、重鎖（heavy
(a)
カラム:
MAbPac SEC-1, 5 µm,
カラムサイズ: 4.0 × 300 mm
移動相:
0.1%ギ酸および
0.05%トリフルオロ酢酸含有水/
アセトニトリル（80:20, v/v）
流速:
200 µL/min
注入量:
5 µL
カラム温度: 30 ºC
検出:
280 nm
サンプル:
(a) mAb
(b) mAb DTT還元
(c) mAb（パパイン消化）
mAb
50
、
chain、
HC ）および軽鎖（light chain、
LC ）
-10
ジスルフィドの還元処理によって得られ
る HCと LC、
またはパパイン消化によって
得られる Fabや Fcといった mAbのフラグ
メントの確認が欠かせません。図2（a ）
で
示すように、
タンパク質を変性させる移動
相、
0.1%ギ酸および0.05%トリフルオロ
酢酸含有水 /アセトニトリル（80:20, v/v ）
で、
mAbのSEC分析が可能でした。図2（b）
で示すように、
重鎖と軽鎖をベースライン
分離できました。図2（c ）で示すように、
Fabと Fcを部分的に分離できました。これ
らは、
MAbPac SEC-1カラムが mAbのフ
ラグメント分析で広くご利用いただけるこ
とを示しています。また、この分析で使用
70
mAU
2
(b)
HC
35
LC
-10
100
(c)
50
-10
3.0
7.5
12.5
min
17.5
25.0
図2：タンパク質が変性する移動相を使用して mAbと mAbフラグメントを分離
カラム:
MAbPac SEC-1, 5 µm,
カラムサイズ: 4.0 × 300 mm
移動相:
50 mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）+300 mM
塩化ナトリウム
流速:
300 µL/min
注入量:
5 µL
カラム温度: 30 ºC
検出:
280 nm
サンプル:
mAb (1 mg/mL)
2
150
2
mAU
2.00
1.43%
0.00
mAU
5 6
7 8 9
ピーク:
1
1. mAb ダイマー
2. mAb モノマー
した移動相は、
質量分析計での検出にも適
しています。
カラムの堅牢性
カラムの堅牢性において、充填剤のパッ
キングは、カラムの寿命だけではなく、正
確で再現性のよい結果を得るために重要
です。MAbPac SEC-1カラムは、
厳しい手
順に沿ってパッキングされているため、
良
0
0
3
6
9
12
好な充填剤の安定性、カラム効率、ピーク
15
min
の対称性が得られます。図3および表1で
図3：連続注入によるクロマトグラム
示すように、
mAbを500回注入後では、わ
ずかにカラムのバックプレッシャーが上
表1 :連続注入によるカラムの堅牢性
注入
モノマー
保持時間
10
100
160
250
319
467
521
7.71
7.71
7.71
7.71
7.71
7.71
7.71
シンメトリー
効率
係数
（理論段数）
（10%）
1.39
1.36
1.37
1.35
1.33
1.35
1.34
7287
7333
7310
7321
7311
7357
7357
昇しました。しかし、
MAbPac SEC-1カ
ダイマー
保持時間
カラム圧
（psi）
6.75
6.75
6.75
6.75
6.75
6.75
6.75
1017
1020
1020
1027
1023
1027
1027
ラムは、
一定の良好な分離、
ピーク形状、
お
よびピーク効率を保っていました。図3
で、
主ピークに対するダイマーのピーク面
積 %を、
クロマトグラムに記載しました。
SEC-MS
SECによる mAbの分析は、タンパク質が
変性しない条件である生体内のpH（6.8）
付近で行うことができます。一般的に使用
される緩衝液は、リン酸緩衝液に300 mM
程度の NaClを添加した移動相です。しか
モノマー
カラム:
カラムサイズ:
移動相:
流速:
注入量:
カラム温度:
検出:
サンプル:
MAbPac SEC-1, 5 µm,
2.1 × 150 mm
20 mMギ酸アンモニウム
50 µL/min
1 µL
30 ºC
Exactive Plus EMR
mAb (1 mg/mL)
ダイマー
し、リン酸緩衝液や高濃度の塩は不揮発
性なので、質量分析計による検出には適
していません。揮発性である20 mMの
ギ酸アンモニウム水溶液を使用すれば、
MAbPac SEC-1および高分解能質量分
析計による分析が可能です。図4（a ）で
示すように、
（2.1 X 150 mm）
MAbPac SEC-1
のカラムを使用して mAbのダイマーの
凝集体とモノマーを分離し、質量分析計
で測定することができました。図4（b ）
と4（c ）
に、
ダイマーの凝集体とモノマー
のマススペクトルを示しています。それ
ぞれのチャージを青で記載しました。
図4：タンパク質が変性しない移動相条件下で、mAbのダイマー凝集体
とモノマーを SEC-MSで分離
3
カラムデータ
Diol
シリカ基材
球状、高純度、全多孔性シリカ
粒子径
5 µm
細孔径
300 Å
カラムフォーマット
4.0 mm内径のカラムはThermo Scientific PEEK TM
7.8 mmおよび2.1 mm内径のカラムはステンレス（SST）
分離可能な分子量範囲
10,000∼1,000,000
分子量限界
>1,000,000
Product Specifications
カラム固定相
仕様と推奨パラメーター
カラムサイズ
（mm ）
推奨流速
（µL/min ）
耐圧
（psi ）
温度限界
（℃）
pH 範囲
MAbPac SEC-1
7.8 × 300
760∼1,000
< 1,000
< 30
2.5∼7.5
MAbPac SEC-1
4.0 × 300
200∼300
< 1,000
< 30
2.5∼7.5
MAbPac SEC-1
4.0 × 150
200∼300
< 600
< 30
2.5∼7.5
MAbPac SEC-1
4.0 × 50
200∼300
< 200
< 30
2.5∼7.5
MAbPac SEC-1
2.1 × 300
50∼75
< 1,000
< 30
2.5∼7.5
MAbPac SEC-1
2.1 × 150
50∼75
< 600
< 30
2.5∼7.5
オーダーインフォメーション
詳細
粒子径
製品番号
MAbPac SEC-1, Analytical, 7.8 × 300 mm
5 µm
088460
MAbPac SEC-1, Analytical, 4 × 300 mm
5 µm
074696
MAbPac SEC-1, Analytical, 4 × 150 mm
5 µm
075592
MAbPac SEC-1, Guard, 4 × 50 mm
5 µm
074697
MAbPac SEC-1, Analytical, 2.1 × 300 mm
5 µm
SP6937
MAbPac SEC-1, Analytical, 2.1 × 150 mm
5 µm
SP6938
Ⓒ 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. 無断複写・転載を禁じます。
ここに記載されている会社名、製品名は各社の商標、登録商標です。掲載されている価格は消費税を含んでおりません。
ここに記載されている内容は、予告なく変更することがあります。詳細については、販売代理店にお問い合わせください。
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〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町3 -9
E-mail : [email protected]
www.thermoscientific.jp
販売店
E1409

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