クロマトQ&A（55）ＱＡ PTC誘導体化アミノ酸分析法 – アミノ酸混合標準液以外のアミノ酸の分析について HPLC法による遊離アミノ酸の分析法としてクロマトQ&A(42)、(52)にPTC誘導体化法が紹介されていますが、アミノ酸混合標準液H 型の混合成分以外のアミノ酸も分析することが可能でしょうか？アミノ基を持つ化合物のPTC化が可能です PTC(フェニルチオカルバモイル)化は、フェニルイソチオシアナート（PITC)試薬(コードNo.：162-08473)を用いて誘導体化する方法で、一級アミンおよび二級アミンに反応します。誘導体化した化合物の分子吸光係数がどのアミノ酸もほとんど同じであるという特長を有しています。多成分のアミノ酸の同時分析にはグラジエント溶出が必要になりますが、Wakopak®Wakosil-PTCと専用溶離液を使用することで簡便に再現性の良いアミノ酸の分離分析が可能です。アミノ酸混合標準液H型(コードNo.：019-08393)の混合成分以外のアミノ酸についても代表的なアミノ酸については、誘導体化して Wakopak®Wakosil-PTCと専用溶離液を用いて分析した際の溶出位置を確認しています。フェニルアラニンの保持時間を１とした時の各アミノ酸の相対保持時間を表１にまとめて示しました。 HPLCで汎用的に使用されている紫外吸収検出器(UV検出器)で、1pmolまでの高感度分析が可能であることも特長の一つで、食品中や生体試料中などの遊離アミノ酸、およびタンパク質やペプチドなどから塩酸加水分解などの方法により遊離したアミノ酸を誘導体化することで、試料中のアミノ酸組成分析が簡便に実施できます。 Table １ Relative retention times for PTC derivatives of various amino acids No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 R.t. (※) 0.191 0.204 0.226 0.259 0.299 0.356 0.362 0.461 0.466 0.482 0.483 0.493 0.512 0.526 0.542 0.545 Amino acid Cysteic acid Phosphoserine Aspartic acid Glutamic acid Carboxymethyl cysteine α-Aminoadipic acid Hydoroxyproline Asparagine Galactosamine Serine Glucosamine Glutamine Glycine Homoserine Histidine β-Alanine No. 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Amino acid Citruline Carnosine Methionine sulfoxide 1 Taurine Arginine Methionine sulfoxide 2 γ-Amino butyric acid Threonine 1-Methyl histidine 3-Methyl histidine Alanine β-Amino butyric acid Proline Methionine sulfone Ammonia α-Amino butyric acid タンパク質構成アミノ酸試料、試薬由来成分（コードNo.：019-08393）Amino Acids Standard Solution Type Hの混合18成分 Fig.1 アミノ酸混合標準液H型の分析例 Ala Pro Thr Arg Gly Ser Asp Glu Lys His No. 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Tyrosine Valine Methionine Cysteine Isoleucine Leucine Norleucine Nitrotyrosine Phenylalanine Tryptophan Ornithine Lysine Reagent N-Methyllysine ※Phenylalanineの保持時間を基準にして算出した相対保持時間。 Column：Wakopak® Wakosil-PTC 4.0mm×250mm Flow rate：1.0mL/min. at 40℃ Gradient：B conc. 0-70％（20min.) Detection：UV 254nm Ile Phe Leu NH3 N R NH C NH CH COOH S C S min. フェニルイソチオシアナート（PITC）フェニルチオカルバミンアミノ酸(PTC-アミノ酸) ●Wakosil-PTC文献：井上逸男，福本昌巳，上森仁志，佐方由嗣，庄司省三，久保田幸穂：生化学，61，1012（1989）. ■HPLC カラムコードNo. D W 235-59281 231-59283 232-59291 238-59293 235-59301 231-59303 品名（カラム名） Wakopak® Wakosil-PTC サイズ希望納入価格(円） 4.0mm×150mm 4.0mm×200mm 4.0mm×250mm 90,000 90,000 90,000 （1）充てん剤名、（2）カラムサイズ、（3）カラムタイプを指定の上ご注文下さい。 ■専用溶離液コードNo. 163-14971 160-14981 R.t. (※) 0.777 0.824 0.854 0.883 0.933 0.945 0.967 0.987 1.000 1.017 1.020 1.063 1.080 1.100 Amino acid 【HPLC conditions】 Column ：Wakopak® Wakosil-PTC（4.0mm×200mm） Eluent ：A）PTC-Amino Acids Mobile Phase A （コードNo.：163-14971) B）PTC-Amino Acids Mobile Phase B （コードNo.：160-14981) linear gradient 0→15min. B conc. 0→70％ Flow Rate ：1.0mL/min. at 40℃ Detection ：UV 254nm 0.32AUS Sample ：PTC-Amino Acids soln.（250pmol） Lys Tyr Met Val R.t. (※) 0.552 0.574 0.577 0.577 0.583 0.586 0.601 0.601 0.606 0.611 0.620 0.635 0.635 0.664 0.676 0.722 品名 PTC-Amino Acids Mobile Phase A PTC-Amino Acids Mobile Phase B 規格 PTC-アミノ酸分析用 PTC-アミノ酸分析用容量 1L 1L 希望納入価格(円） 8,000 8,400 規格容量 5mL 1mL用×5 1mL用×5 5mL用×5 希望納入価格(円） 4,200 6,300 8,900 22,000 ■試薬・標準液コードNo. 013-08391 019-08393 162-08473 166-08476 品名 Amino Acids Standard Solution, Type H アミノ酸自動分析用 Phenyl lsothiocyanate アミノ酸自動分析用クロマトQ&A バックナンバー http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/chromato/article/FAQ.htm 過去の「アナリティカルサークル」に掲載したクロマトQ&Aを当社HPでご覧いただけます。 06 (O.Y.)