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Title
銅耐性酵母の銅メタロチオネインＩＩ : メタロチオネイン
の末端基
Author(s)
内貴, 信夫
Citation
[岐阜大学教養部研究報告] vol.[23] p.[31]-[37]
Issue Date
1987
Rights
Version
岐阜大学教養部生物学教室 (Department of Biology, Faculty of
General Education, Gifu University)
URL
http://repository.lib.gifu-u.ac.jp/handle/123456789/47611
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
31
銅耐性酵母の銅メタロチオネイン II
メタロチオネイソの末端基
内
貴
信
夫
岐阜大学教養部生物学教室
( 1987年10月 8 日受理)
Copper- M etallothioneins in a Copper- R esistant
Y east Strain I I .
T erminal Residues of M etallothionein
N obuo N A I K I
Department of Biology, F aculty of General E ducation, Gifu U niversity
SUmmary
Purification of Cu-thionein I I , a m ajor component among the Cu-thioneins of yeast cultuerd in the
medium containing lmM Cu, w as achieved by repetition of gel filtration ( Sephadex G50) and anion
exchange chromatography ( DE A E - Sephadeχ A 25) .
T he component w as electrophoretically pure on
acryl amide ge1.
`
W hen intact thionein ( Cu-M T ) or performic oχidized thionein ( O-M T ) reacted w ith dinitonuorobenzene or dansyl chloride in alkaline buffer, no N H 2-terminal amino acid w as detected. Gas-liquid
chrom atographic analysis of thehydrolyzate of this component indicated that aceticacid w as produced
from the component by the hydrolysis. T hen, N -terminus of this component is assumed to beblocked
by an acetyl residue. 0 n the other hand, hydrazinolysisof O-M T suggested that COOH -terminal amino
acid is lysine.
T he same result w as obtained from the digestion experiments of O-M T with the
carboχypeptidase ( CP-A or CP-Y ) . ln theseenzymatic experiments, the secondary amino acid from
C-terminus was also supposed to be glycine.
は
じ
め
に
有害な濃度の重金属イオン環境下に生体がおかれると, その毒性を軽減するため生体は多量の金
属と強い結合をするタンパク質゛メタロチオネイソ″を生産する。現在までに脊椎動物, 無脊椎動
物, 植物及び微生物等多くの生物種でこの生産が報告されている。
植物のメタロチオネイソに関しては, アミノ酸配列までの解析は進んでいないが, 動物や微生物
ではその全アミノ酸配列や, チオネイソをコードする遺伝子の塩基配列の決定が行われている。一
般的に哺乳類より得られるメタロチオネイソは, その起源や種類の違いにかかわらずその構造は非
常に類似し , 61ヶのアミノ酸より構成されN 末端はアセチル化されたメチオエンで始まり, C末端
はアラニンで終る。これに対して無脊椎動物以下では, その構成アミノ酸数や両末端は種々で N 末
32
内
貴
信
夫
端は修飾を受けていない。
この報告は銅イオンにより誘導された酵母メタロチオネイソの末端基に関するもので, C末端は
すでに報告された酵母のメタロチオネイソと同じ結果となったが, N 末端がアセチル基でブロック
されている可能性を指摘したものである。
材料と方法
銅ヂオネインの精製と銅の除去-
1mM 含銅液体培地で増殖した Sacck yomyces ceyelX
isiae の
生重量約180g を 80℃ 3 分熱処理して得た抽出液より, セファデックス G50と DEAE- セファデック
スA 25カラムを交互にくりかめし通過させることにより酵母メタロチオネイソの主成分である Cu
-MT II B ( 以下 Cu-MT とする) を約35m9分取した1)。等電点電気泳動による精製法はアソホライ
ソ担体と Cu-M T の分離が困難なため今回の標品の精製過程では使用しなかった。しかし分画した
Cu-MT はアクリルアミドゲル電気泳動的に単一なバンドを示した。末端アミノ酸の決定にはタン
パク質の立体構造を壊し変性させることが必要である。ここでは変性に過蟻酸酸化を行い凍結乾燥
後セファデックス G25カラムを通して銅を含む低分子物質を除き酸化されたチオネイソ (O-MT)
を集めた。この O-M T のゲル泳動像は Cu-MT より移動速度の減じた位置に幅の広い単一バンド
として行動した 1)。この報告でのタンパク質定量はすべてローリー法を採用した。
揮発性有機酸の定性と定量→
-MT 中の有機酸の検出には, このタンパク質の加水分解物を
エーテルで抽出し, ガスクロマトグラフィーを用いて測定した2・34)。約4. 5mgの凍結乾燥した O-MT
に0. 1m1の12N 一硫酸または 6 N 一
塩酸を加え, 窒素ガス封管中で105℃で 4 時間加水分解を行った。
これとは別に加熱操作を省略した対照を用意し, 両者の差を加水分解により遊離した有機酸として
求めた。加水分解はエーテル抽出に先だち内部標準液として20μg のプロピオン酸を加え, 0. 5m1の
エーテルで氷冷下 4 回の抽出を行った。抽出操作毎に遠心分離機にかけ上層部をパスツールピペッ
トで一本の共栓試験管に集め 6 N苛性ソーターの微量でアルカリ性とした後, 窒素ガスを細管より
ふきつけてエーテルをのぞき乾固した。この乾燥試料に10μ1 の12N一
硫酸と0. 5m1のエーテル及び
100mgの芒硝を加えて抽出を行い, ガスクロマトグラフィーの試料とした。用いた装置は島津製ガス
クロマトグラフィーGC-4CM で分析の諸条件は図 2 の説明に詳述した。
C末端アミノ酸の定性と定量C末端の検出にはヒドラジン分解法及びカーボキシペプチダー
ゼによる消化分解法の両者を試みた。
i ) ヒドラジン分解法一乾燥した O-M T の約 3 mgと硫酸ヒドラジンの25mgを分解管にとり0. 2
m1のヒドラジン (b.p., 113.5℃ ; m.p., 14℃) を加えて減圧下60℃で16時間の加水分解を行った。
その後分解管は濃硫酸を設置した真空デシケーターに入れ水流ポンプ減圧下に 4 時間たもち大部
分のヒドラジンを除去した。シロップ状の残澄は凍結乾燥により乾固し , 2 m1の水にとかしてベ
ソチルアルデハイドで大部分のアミノ酸ヒドラジッドを抽出除去して水層部を集めクェソ酸緩衝
液 ( pH2.8) で希釈してアミノ酸分折機で分折した。
ii) 酵素消化法- -C末端検出に用いたカーボキシペプチダーゼは牛のすい臓から精製された CP
-AnErと酵母より精製された CP-Y でともにシダマー社の製品である。反応液に使用した緩衝液
は CP-AE rは0. 2Mエチルモルフォリソー酢酸液 (pH8. 5) で CP-Y は0. 1M リソ酸緩衝液 (pH
6. 5) である。約4. 5mgの O-MT と0. 2% ラウリル硫酸を含む3. 5m1の緩衝液を30℃に保温しながら,
200μg/m1のカーボキシペプチダーゼを含む緩衝液の0. 5m1( CP-AI)Erは約5. 3U , CP-Y は約 9 U)
を加えて反応を開始した。 0. 5, 1, 2 , 4 , 8 時間の間隔で反応液の0. 6m1を取り出し , 100℃ 3
分の熱処理で反応をとめ, 遠心分離した上清液に同量のクェソ酸緩衝液 ( pH2. 8) を加えてアミノ
酸分折の試料とした。
銅耐性酵母の銅メタロチオネイソ II
結
N末端アミノ酸の検出-
33
果
N 末端アミノ酸を検出するためジェトロフルオロペッセッ法6)及びダ
ソシルクロリッド法6)の両者を CU-M T 及び O-M T のそれぞれに用いてみたが, いずれの場合も
リシソのε- アミノ基誘導体が多量に検出され末端アミノ酸は確認できなかった。即ち FDNB 法で
は塩酸加水分解後の試料をエーテル抽出すると, 黄色の大部分は水層部に残り, この分画は炉紙ク
ロマトグラムの結果 ε-DNP リシソが検出された。一方エーテル可溶分画のクロマトグラムでは
DNP- グルタミン酸の位置に痕跡量のスポットを観察したが, 用いたタンパク質 ( 分子量5, 000とし
て) のモル量に比して極めて少く , これが N 末端を形成しているとは考えにくい。またダッシル化
したタタロチオネイソの加水分解物のポリアマイド薄層クロマトグラムの結果はε-DNSづシッ以
外に紫外線下で黄色けい光を示すものはみられなかった ( 図 1) 。したがって N一末端のアミノ基は
ブロックされている可能性が強い。
Fig. 1.
Chromatograms of dansyl- amino acids on
Polygram
thinlayer sheet ( P olyam ide-6U V
254) . A bout 0.25mg of protein ( Cu-M T or O
-M T ) wasdissolved in 0.5ml of 0.5M NaHC0 3
containing 1%
SD S, successively added 0.5ml
of acetone solution contained dansyl chloride
( 20mg/ml) .
The solution was allowed to
stand ovem ight at room temperature.
A fter
this period the dansylation protein w as collected by passing the solution through a Sephadex G 25 column, and hydrolyzed with 6N
H Cl at 105℃ for 18hrs. T hespotsweredetected under U . V . irradiation.
M obile phase : A , benzene/ acetic acid= 9/ 1 ;
B, 2% formicacid ; C, ethylacetate/methanol/
acetic acid二 20/ 1/ 1 ; D, 0.05M
N a3P0 4/ eth-
ano1= 3/1. 1, hydrolysis of DNS-Cu-MT ; 2,
hydrolysis of D N S-O- M T ; 3, ε-D N S-lysine ;
4, di-D N S-lysine ; 5, DN S- serine ; 6, D N S
-glutam ic
acid
;
7,
D N S-aspartic
acid.
A uthentic samples ( from 3 to 7) were products
of the Sigma ChemicaI Co.
有機酸の検出べ
)-M T を 12N硫酸または 6 N 塩酸とともに105℃ 4 時間加水分解したものと,
加熱操作をしなかった試料のガスクロマトグラフィーの典型的な結果は図 2 で見られる。いずれも
酢酸以外には内部標準液として加えたプロピオン酸のみが検出された。 2 回の実験より得られた酢
酸の定量値は表 1 に示した。
12N 一
硫酸による加水分解は分解液が淡黄色を呈し分解物の一部が炭化している事をうかがわせ
るが, 定量値は塩酸による加水分解よりやや高い値を示している。分解に使用した O-MT は約4. 5
m
gで0. 9μmoleに相当する。酢酸の定量値より求められる値は約0. 7μmoleでモル比では酢酸がいく
ぶん少いが, タンパク質の定量値やエーテル抽出操作による誤差を考慮すれば, やむを得ない値と
思われる。
C末端アミノ酸の検出
る消化分解法を採用した。
i ) ・ヒドラジン分解法-
C末端の検出にはヒドラジン分解法とカーボキシペプチダーゼを用1,
●
。
・
3mgの O-MT をヒドラジン分解し, アミノ酸分折機により検出される
ニンヒドリソ陽性物質の最も顕著なピークはヒスチジン,
・
リシソとアソモ・ニアの位置のもので
内
34
貢
1言
夫
Fig. 2.
Gas chromatography of volatile organic
acids extracted into ethylether from O-M T
esuodseS ﹂のでOUΦぼ
hydrolyzate.
Shimadzu gas chromatography
GC-4CM apparatuswasused under the following operating conditions : injection tempera-
ture, 150℃ ; column temperature 120°
C ; nitro,
gen flow rate 60ml/min.
extrad
column.
Two μl of the
w as injected onto a glass precoiled
T he column ( 0. 5 × 180cm)
w as
packed w ith U nisole F -200 ( Gasukuro K ogyo
I NC.) . Propionic acid as a internal standard
was added to;the sample before ether extractions. Solid line ; hydrolyzed w ith 12N H 28 0 4
at 105℃
for 4hrs. ,
broken line ; hydrolysis
omitted.
T able 1
Determination of acetic acid in O- M T hydrolyzate by the gas
liquid chromatography・
T reatment
ln 6N H CI ,
4hrs at 105℃
A cetic acid
A cetic acid obtained
observed ( μmoles)
by hydrolysis ( μmoles)
0 . 83
0 . 69
ln 6N H C1,
hydro】ysis omitted
ln 12N H 28 0 4,
4hrs at 105℃
0 . 14
0 . 92
0 . 77
ln 12N H 28 0 4,
hydrolysis omitted
0 . 15
あった。ヒスチジンの位置に見られるピークは正規のピークとくらべると幅の広いかなり変形し
たもので, おそらく処理中の副産物による可能性が強い。ヒスチジン,
リシソの両ピークは定量
的にほぼ等しいモル量を示すが, このモル量は分解に用いた O-MT のモル量と比較しておよそ
半量の値であった。
酸性及び中性アミノ酸領域にも特定できない不明のピークを含めて約12ヶの起伏が見られる。
この中で比較的明瞭なものはセリソとグリシンであるが, 共に使用した O-M T のモル量にくら
べて 1/ 5 ~ 1/ 8 のモル量であった。
ii ) 消化分解法-- 0 -MT やカーボキシペプチダーゼを含む 4 m1の反応液から各時間毎に一定量
を取り遊離するアミノ酸を分析した結果は図 3 のようになった。 CP-Ar)Erを加えた直後 ( O時間)
の分析ではカラムに吸着されずに流出するシステイン酸の位置とアンモニアの位置に高いピーク
が観察される。システイン酸の位置に溶出する分画は多量のシステイン酸残基を含む非吸着性の
O-MT と思われる。このピークは反応の進行とともに減少する傾向を示した。またアンモニアの
ピークは CP-A 標品からの持ち込みによるものである。定量値の顕著な上昇を示したものはリシ
ッでありグリシンがこれに続く ( 図 3 A ) 。図では示さなかったが22時間後検出されるアミノ酸は
銅耐性酵母の銅メタロチオネイソ II
リシソ, グリシン, セリソ, スレオエン,
35
p イシソ, イソロイシン,
ヒスチジン, グルタミン酸
でロイシン以下は量的に極めて少い。 22時間後に生産されるリシソのモル量は使用した O-M T
のモル量の半量以下であった。実験前の CP-A の活性はベソゾイルーフェニルアラニソを用いて
テストされ, 十分な活性を検出しているので, 0 -M T に対しこの酵素は極めてゆるやかに反応す
るもめと思われる。
(selouJ
y
f
E ) pesDeleU pl
oV ou一
Eく
2
4
6
8
1ncub【】↑lon Time( h「」
lncubQ↑ion Tlme ( hr)
Fig. 3.
D etermination curves of amino acidsreleased from O-M T w ith the digestion of carboxypeptidases. T o
4ml of the reaction miχture w ere contained about 4.5mg of O- M T , 0.2%
SDS and 200μg of the carboχype-
ptidase. A t appropriate intervals, the reaction mixture of 0.6ml w as remo、
ved, and the reaction w as stopped
by boiling for 3min.
A fter centrifugation, the samples were diluted with a citrate buffer ( pH 2.8) and
analyzed. A ; used carboχypeptidase-A ( from bovine pancreas) w ith 0.2M ethylmorpholin-acetate buffer
( pH 8.5) , B ; used carboxypeptidase-Y ( from bakeres yeast) with 0. 1M phosphate buffer ( pH 6.5) .
CP-A のかわりに CP-Y を用いて同様の実験を行った結果は図 3 B で示される。リシッの定量値
が最初に上昇するのは CP-A の場合と同様であるが, グリシンとセリソはほぼ同様の勾配で上昇し
た。いずれも遊離される C末端アミノ酸は CP-A の時より一層量的に少い結果となった。
考
察
種々の哺乳類よ・り分離されたカドミウムチオネイソはその種間や抽出臓器の差違, またチオネイ
ソの種類 ( M T-I, M T-II) の違いにかかわらず, アミノ酸配列はよく類似し20システイン残基を含
む61~ 62のアミノ酸よりつくられている。いずれも N 末端はアセチル化されたメチオユンで始まり
C末端はアラニンで終っている7・8・9・lo)。ネズミ肝の Cd-M T の DNA レベルの研究でも, その塩基
配列より推定されるアミノ酸配列はN 末端がメチオユン, 61番目のC末端はアラニンで, 上記タン
パク質のアミノ酸配列から求められた結果と一致する11・12・13)。
一方無脊椎動物や微生物から得られる Cd-MT や Cu-MT は構成するアミノ酸の数や末端基に
大きな違いがある。たとえばカニの M T-1 は58残基, MT-2 は57残基で N 末端はともに修飾を受
けないプロリンであるが, C末端は前者はスレオエン, 後者はプロリンである14)。ウェ 15)やショウ
ジョウバエ16)では MT 遺伝子の塩基配列より推定される構成アミノ酸数は, ウユで64, シ日ウジョ
ウバエ40で N 末端は塩基配列からの推定のため共にメチオユン ( 翻訳開始コドソ ) であるが C末端
はウユではシステイツ , ハエではグルタミン酸である。微生物のアカパンカビの Cu-M T は構成ア
ミノ酸数は25残基で極端に短く N 末端はグリシン, C末端はリシソである。これ等無脊椎動物及び
微生物にみられる M T は長さや末端アミノ酸に差異があるが, M T の特徴的な配列である-CyS- χ
内
36
貴
信
夫
-CyS, や-CyS-CyS一
配列は哺乳類の MT と同様高い頻度で含まれている。
酵母Cu-MT の全アミノ酸配列は木村18)及び W inge等19)により報告され, またこの遺伝子である
CUP-1 の塩基配列もKarin等20)により報告されている。構成アミノ酸数は木村は42, W inge等は53
であり, この間n ケのアミノ酸の違いがある。一方塩基配列から推定されるアミノ酸数は61ケであ
るが W inge 等によるとメチオユンから始まる N 末端 8 ヶのアミノ酸が切断されて機能すると考え
ている。この 8 ケがのぞかれると W inge 等とKarin 等のアミノ酸配列はみごとに一致している。
また塩基配列から推定される N 末端は 8 ケがのぞかれるとグルタミンとなり, 木村及び W inge 等
のN 末端のグルタミンと一致する。
この報告ではN 末端アミノ酸の同定に DNFB 法とダソシルクロリッド法が用いられたが, いず
れも N 末端を特定できなかった。もしグルタミンがN 末端を形成するなら加水分解の結果はグルタ
ミン酸誘導体が得られるはずである。そこでタンパク質の加水分解により遊離する有機酸をガスク
ロマトグラフィーで求めた結果使用したタンパク分子の約 3 / 4 の酢酸を検出した。したがって N 末
端は哺乳類の M T と同様アセチル基と結合しているものと考えられる。アセチル基の結合している
アミノ酸の種類は, この実験では求められない。
C末端の同定はヒドラジン分解法とカーボキシペプチダーゼによる消化法を用いた。いずれの場
合も C末端はリシッが検出された。特に消化法ではC末端より 2 番目のアミノ酸がグリシンである
可能性が指示された。 C末端がリシソである点は木村, W inge等及び Karin等の結果と一致する。
C末端より 2 番目のアミノ酸は木村ではスレオエンと報告されているが, 後者二人の報告はグリシ
ンでここで報告した結果と一致している○
。
要
旨
1mM の含銅培地で生長した酵母より電気泳動的に均一な酵母銅チオネイソを精製した。ジェト
ロフルオロベソゼソ法やダソシル法やダソシルクロリッド法で N 末端アミノ酸を求めたが, 検出で
きなかった。このタンパク質の加水分解物のガスクロマトグラフィーから酢酸の存在を確認した。
したがって N 末端はアセチル基でブロックされていると思われる。 C末端のアミノ酸をヒドラジン
分解やカーボキシペプチダーゼの消化分解法でしらべたところ ,
リシソであることがわかった。ま
た C末端より二番目のアミノ酸はグリシンである可能性が同じ消化分解法の結果から類推された。
引
(1)
用
内貴信夫 ( 1987) 銅耐性酵母の銅 y タロチオネイソー
文
献
精製とアミノ酸組成一
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