Space Utiliz Res, 23 (2007) ©ISAS/JAXA 2007 微小重力条件下で V 型コラーゲン線維を利用したアダルト腎糸球体と発生期尿管芽の融合筑波大学生命環境科学研究科王碧昭、村澤裕介 Fusion of adult glomruli and developmenting ureteric buds by type V collagen fibrils under microgravity Pi-Chao Wang and Yusuke Murasawa Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba City, Ibaraki, 305-8572 E-Mail: [email protected] Abstract: Human kidney consists of one million of nephrons which is the basic unit for the filtration of blood, excretion of urine, secretion of cytokine and re-absorption of electrolytes. Every nephron comprising glomerulus and tubule with complicated structure and full of blood capillaries can hardly be re-constructed by current techniques. In this study, we constructed nephrons by fusing adult glomeruli to ureteric buds with a newly dynamic scaffold-type V collagen fiber under micro-gravity. Type V collagen fiber was reconstituted in vitro and used as a new scaffold for cell and tissue culture in this study. Key words; glomeruli, ureteric bud, type-V collagen fibril, fusion, microgravity 現在、再生医療的に腎患者を治療するアプローチは未知であり、機械的透析機があるとはいえ、イオン再吸収など、糸球体機能の具現化した人工腎臓、ホメオスタシスの維持を具現化した腎の回復研究は皆無であり、特に、毛細血管路と上皮尿路との融合形成からなる糸球体組織再生が難しい。近年、発生期腎組織を用いた in vitro での腎構築が試られているが、腎糸球体部分の血管組織が形成されず、機能するネフロン形成の知見は未だ得られていない。発生期後腎の組織形成は、上皮系尿管芽と周囲間葉との協調成長、間充織細胞の分化から由来する上皮、血管内皮細胞の糸球体形成、既存血管浸潤由来、腎内細動静脈網の各組織化の相転移が絡み合って進行する。このとき、細胞と因子の住み分けと交流が大事になる。我々が新たな細胞足場（細胞外マトリクス、ECM) −V 型コラーゲン−を着目し、コラーゲン繊維を再構築した。V 型コラーゲン繊維を用いた腎糸球体細胞の培養実験を行った結果、糸球体細胞に対し V 型コラーゲン繊維が三つの役割を解明した。①細胞が自由運動しながら、接着している状態を作り出す、形態変化過渡期の環境を提供する。②細胞間相互作用を高め、組織化を進める ECM である。③早急に消化され、一過性で存在し、次環境にバトンタッチする ECM でもある。我々は V 型コラーゲン線維が細胞周辺の微小環境にダイナミクス化と安定化を与えるする特徴を着目し、細胞足場の微小環境をダイナミクスとニッチ安定との反復を許す、自由ニッチこそが腎組織形成の鍵であると考え、この自由ニッチを誘導する V 型コラーゲン繊維を利用すると同時に、胎児が母体の羊水中に成長する環境を模擬する、擬微小重力を導入する。この V 型コラーゲン線維を足場とする静置培養系と、微小重力を導入する擬微小重力培養系に、アダルト糸球体と発生期後腎と共培養することで、腎糸球体形成、尿細管と糸球体との融合、血液と尿の流路形成という一連の流れの解明に挑んで、臨床実用化可能な腎臓の in vitro 構築技術開発を目的とする。具体的な方法としては、静置培養プレートと擬微小重力培養装置（RWV：Rotary Wall Vessel）を使用し、３次元培養環境を発生期後腎とアダルトの腎糸球体の協調培養系に与えた。アダルトマウス腎糸球体はメッシュ法で単離し、数十個を RWV に導入する。マウス発生期後腎は E11.5∼E17 までの後腎組織を６個∼１８個まで数を振って、RWV 中で３次元培養をした。V 型コラーゲン線維とＶＥＧＦ,bＦＧＦ,ＨＧＦ,ＮＧＦなどの血管形成に関わる因子を組み合わせ、各因子を経時的に投入、培養３日後と１週間後で固定し、凍結切片を HE 染色、エラスチカ染色、免疫染色し、上皮系形成と血管系形成を評価した。結果、本系では、アダルトの糸球体と発生腎臓とが、V 型コラーゲン線維を介して融合できるということを示せた。しかし、この方法では尿管と糸球体の融合は可能であっても糸球体内血管網の形成と、糸球体内外を繋ぐ血管形成ができなかった。原因は、 V 型コラーゲン線維 ECM 由来の自由ニッチ維持が長続きしないことにある。培養 3 日以上の in vitro This document is provided by JAXA. 培養では、V 型コラーゲン線維 ECM は IV 型 ECM にマトリクスタイプが変遷してしまい、組織が硬化して、自由なニッチ環境が消えてしまうのである。片にし、免疫染色で観察すると、糸球体内部が血管形成の初期マーカーである FLK-1 ポジティブであることから、糸球体毛細血管の形成が証明された。 Fig. １. Adult glomeruli were fused to the tip of developmental ureteric buds. Fig. 3. Immunostain of the fused kidney show blood capillaries are formed around glomeruli. Red: Flk-1 (early stage marker of angionenesis or vasculogenesis) しかし、RWV と V 型コラーゲン線維を使用した結果、複数個の発生期後腎組織が融合し、糸球体血管系が誘導されることを明らかにした。 Fig. ２. Metanephros and Adult glomeruli were fused to form a big kidney 微小重力下で融合した後腎の成長は単独培養した後腎の１０倍大きさになった。１週間後の形成組織を切片で観察すると、融合した腎臓の皮質辺縁は通常腎臓と同様、沢山の糸球体が観察された。また、細動静脈では血球が数多く存在し、血流が形成できたことが判明、エラスチカ染色では、血管基底膜形成を確認できた。形成された培養１週間後組織を切また、血管形成の後期マーカである Tie-2 で染色した結果、同様に糸球体内外の小動脈が染色された。これは、微小重力と V 型コラーゲン線維の条件が血管形成を誘導することを示唆された。さらに、アダルト糸球体内皮細胞を培養するときと同様に、培養１週間後、V 型コラーゲンだけではなく、IV 型コラーゲンも現れた。これは、V 型コラーゲン線維が腎糸球体基底膜成分である IV 型コラーゲンを細胞に誘導し分泌させた。面白いことに、V 型コラーゲン線維の存在しない培養系では、後腎の融合ができたものの、組織の構造がすかすかであるし、糸球体や血管の形成が観察されていない。これは、腎臓構造を維持する ECM の欠乏が原因であると考えられる。従って、融合した後腎の血管形成は、微小重力と ECM 両者が必要と考えられる。特に、RWV で糸球体と後腎組織の融合ができたについて、多数の発生後腎組織の融合による因子の補完と、重力の軽減、投入 V 型コラーゲン線維が適所にたどり着けたことを理由に考えている。本実験で示された腎血管形成システムの詳細を解明することで、腎血管系形成における新しいニッチ誘導が提示される。 This document is provided by JAXA.