ポスト抗体医薬：疾患関連タンパク質をターゲットトした分子標的ペプチドの網羅的創出技術大阪府立大学大学院理学系研究科・藤井郁雄 21世紀科学研究機構ケミカルバイオロジー研究所・所長立体構造規制ペプチドから低分子医薬へ：新しい分子標的化合物の創出法タンパク質立体構造を取得立体構造をもとにした医薬品設計（SBDD）Ｘ線結晶解析，NMR 長い時間がかかるヒット化合物タンパク質構造からファーマコフォアを取得標的タンパク質 •タンパク質の立体構造なしヒット化合物 CC & HTS タンパク質の立体構造なし作用物質の構造なし低分子ライブラリーの取得（4000円Ｘ320万種＝128億円） •作用物質の構造なし新手法高コスト作用物質構造を取得立体構造規制ペプチド進化分子工学ペプチド・ライブラリー（205 = 320万種類）ヒット化合物作用物質の構造からファーマコフォアを取得・標的たんぱく質の立体構造がいらない：スピードアップ・ライブラリー構築が容易：低コスト 2008年の世界の医薬品売り上げ順位製品名薬効メーカー分類特許満了年 1 リピトール高脂血症/スタチンファイザー/アステラス低分子 2011 2 プラビックス抗血小板薬サノフィ・A/BMS 低分子 2011 3 アトドベア/セレタイド 4 リツキサン 5 エンブレル 6 レミケード 7 ディオバン降圧剤/ARB ノバルティス/イプセン低分子 2012 8 ネクシアム抗潰瘍剤/PPI アストラゼネカ低分子 2014 9 エポジェン腎性貧血アムジェン/J &J/ キリンタンパク製剤 2004 10 アバスチン抗がん剤/結腸・乳がんジェネンテック/ロシュモノクローナル抗体 - 11 ハーセプチン抗がん剤/HER2乳がんジェネンテック/ロシュ/ 中外モノクローナル抗体 2013 12 ジプレキサ統合失調症薬イーライリリー低分子 2011 13 セロクエル統合失調症薬アストラゼネカ/アステラス低分子 2011 14 シングレア/キプレス抗喘息/気管支喘息メルク/キョーリン低分子 2012 15 ヒュミラ関節リウマチ/乾癬他アボット/エーザイモノクローナル抗体 - グラクソ・スミスクライン低分子 /アルミラルバイオジェン・アイディ非ホジキンリンパ腫モノクローナル抗体ク/ロシュアムジェン/ワイス/ 武抗体組み替えタンパク関節リウマチ/乾癬他田製剤関節リウマチ/クローン J&J(セントコア)/SP/田モノクローナル抗体病他辺三菱抗喘息薬 2010 2014 2009 2014 抗体医薬品の台頭とその問題点問題点 巨大タンパク質(MW:150 kD) 抗体 150 kD 多数のジスルフィド結合による構造形成 抗原性：ヒト化が必要 細胞膜を透過しない 動物細胞による生産が必要 特許の高い壁乳がんの手術後再発予防の治療費: 従来の化学療法剤による治療では50～60万円程度のところ、トラスツズマブ（ハーセプチン®）は300万円を超える。 Beyond Antibodies: 抗体から次世代抗体へ抗体様分子標的ペプチドの創出マイクロ抗体 ペプチド(MW:3-5 kD) 抗体 150 kD 非抗原性：ヒト化が不必要 細胞膜透過性：細胞内タンパク質が分子標的になる 化学合成が可能コストが安い 特許の縛りがない研究戦略立体構造規制ペプチド・ライブラリーの開発低分子リード化合物の設計と合成マイクロ抗体バーチャル・スクリーニング作用ペプチドコンビバイオによるハイスループット・スクリーニングファーマコフォアの立体構造情報 320万種類（205）の分子ライブラリーを１晩で調製することが可能ファージ表層提示ライブラリー・スクリーニング大腸菌蛍光再感染増幅洗い出し選別アンタゴニスト・アゴニスト標的タンパク質ペプチド・ライブラリー α-ヘリックス構造を有するペプチド・ライブラリーの分子設計サイトカイン（a-ヘリックス含有たんぱく質）へリックス・ループ・へリックス構造 helix-loop-helix IL-6, G-CSF: 関節炎治療薬 G7 IL-4, IL-5:抗アレルギー薬、抗喘息薬 K22 E9 L10 L23 X25 L26 X28 A8 L6 A5 A4 L3 A1 N E2 X24 K29 L30 X31 X32 L33 A35 C ライブラリー領域構造支持領域 A11 L12 A12 ペプチドの分子設計 ■35 アミノ酸から構成される。 ■N-末端 a-へリックス、グリシン・ループ、C-末端 a-へリックスの３部分から構成される。 ■ロイシン側鎖の疎水相互作用により２つのへリックスが会合し安定化する。 ■グルタミン酸側鎖とリジン側鎖の静電相互作用により２つのへリックスが会合し安定化する。 α-ヘッリクス構造ペプチドの分子設計：ヘリックス・ル－プ・ヘリックス構造の安定性 N-terminal segment C-terminal segment CD spectra of peptides α-ヘッリクス構造ペプチドのファージ・ディスプレイ・ライブラリ－ A peptide library was displayed on gVIII coat protein of phage by a modification of the pComb8 system Library size: 1.8 x 106 G-CSF 受容体に対する親和性ペプチドの創出 G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor ) 顆粒球コロニー刺激因子白血球の１種である好中球の分化・増殖を誘導する糖タンパク質。分子量約1.8-2.2万で、ヒトで 174アミノ酸から構成される。骨髄移植時の好中球の増加促進剤や抗ガン剤の副作用である好中球減少症の治療薬として使用されている。 Ig-like BN BC Cytokine Receptor Homologous Region FNIII-like Cell membrane Cytoplasm Crystal structure of a complex of the receptor BNBC domain (CRH) with G-CSF G-CSF 受容体結合ペプチドの立体構造と受容体結合活性の相関 peptide sequence Kd (µM) scaffold 1 AELHALEHELAALEG(7)KLAALKAKLAALKAY >1000 pep 2 AELHALEHELAALEG(7)KLSDLKLKLPELKAY 150 pep 4 AELHALEHELAALEG(7)KLSDLKLKLAELKAY 28 pep 5 AELAALEAELAALEG(7)KLSDLKLKLAELKAY 2 3 4 1 3.8 G-CSFR分子標的ペプチドの特異性 SPR spectra 120 G7 A11 A12 E9 A8 A4 L12 A5 A1 L10 L6 E2 L3 G-CSFR K22 80 L23 M25 L26 A24 L28 K29 L30 E32 A31 Kd = 214 nM % helix = 34 % Human IgG 40 L33 R35 Y N C 0 P8-2KA Peptide = 500 nM (BiaCore T-100) 時間（t）高い特異性：ヒトIgG-Fc, IL-4受容体,I L-5受容体, VEGFには全く結合しない。分子標的ペプチドの最適化： BIACOREを用いたG-CSF受容体結合性ペプチドの熱力学解析 A C C Y A Y C HN Kd = 214 nM % helix = 34 % P8-2KA Kd = 3 nM % helix =59 % P8-2KA-S (Disulfide) S O Kd = 4 nM % helix = 41 % P8-2KA-S (Thioether) peptide conc.12.5 nM. temp.: 10 - 37 ℃ 次世代抗体としての可能性マイクロ抗体 helix-loop-helix 次世代抗体としての可能性 安定性？ 非抗原性？バイオアッセイ：細胞増殖阻害試験細胞増殖阻害試験 NFS60細胞 : 4×104 G-CSF : 200pM OD570 P8-2KA P8-2KA-S Peptides IC50 P8-2KA 50 μM P8-2KA-S 75 nM チオエーテル化P8-2KA-S 90 nM チオエーテル化P8-2KA-S A P8-2KA ペプチド濃度（μM） C C A Y P8-2KA-S Y C H N S O P8-2KA Kd = 214 nM IC50 = 50 µM X 71 X 666 チオエーテル化 P8-2KA-S Kd = 3 nM IC50 = 75 nM P8-2KA-S 血清中安定性試験安定性試験マウス血清中半減期 peptides 残存ペプチド量(%) チオエーテル化P8-2KA-S P8-2KA-S half life P8-2KA 6.3 hour P8-2KA-S 5.25 day あああああああああああ 15.25 day チオエーテル化P8-2KA-S 0.5hour P8-2KA C末 P8-2KA P8-2KA C末時間（分） A P8-2KA C C A Y P8-2KA-S Y C H N S O チオエーテル化 P8-2KA-S 次世代抗体としての可能性: 非抗原性 7/27 Balb/c mouse 8/10 2 weeks immunizatio n 8/24 2 weeks 8/31 Titration Curve 1 . 2 microAb-KLH 1 week + adjuvant* immunizatio n immunization Titer 1 (50 µg/mouse) (1) O D 4 9 0 microAb 0 . 8 microAb + adjuvant* 0 . 6 + adjuvant* (2) 0 . 4 microAb 0 . 2 microAb (3) KLH + adjuvant* 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 d il u t i o n s *Adjuvant: AbISCOTM (12 µg / mouse) 5 1 0 分子標的：血管内皮細胞増殖因子 Vascular endothelial growth factor (VEGF) VEGFは、脈管形成および血管新生に関与する一群の糖タンパク。VEGFは主に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR) にリガンドとして結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させる。正常な体の血管新生に関わる他、腫瘍の血管形成や転移など、悪性化の過程にも関与している。 Functions Migration Invasion proliferation Survival Permeability Lymphangio -genesis angiogenesis Lymphangiogenesis Tumor growth 抗VEGFマイクロ抗体の結合活性 Trx-49 A C C KD : 3 nM Trx-42 A thioredoxin Ｃompetitive binding assay with Trx-42 (VEGF 25 nM) for VEGFR-2 VEGF 25 nM thioredoxinfused peptide 0 nM 87 nM 175 nM 350 nM 700 nM 1400 nM KD : 300 nM 細胞増殖阻害活性ヒト臍帯静脈内皮細胞（Normal Human Umbilical Vein Endothelial Cells : HUVEC） (Ala mutant) (anti-TNF α pep.) 立体構造規制ペプチドライブラリーファージ表層提示法，酵母表層提示法 X18 X18 X17 G7 X20 X16 L12 A12 A11 E L30 5 A1 L26 E 2 E L 3 X3 X32 1 E 2 L 3 L33 E A2 8 1 A32 N C Loop L26 X28 L30 6 5 A1 E X24 X25 K29 L A A4 K22 L23 9 A8 A3 L10 L 3 2 X3 X32 1 L33 A3 5 5 C α−helical A11 A3 5 N X20 L12 A12 L26 L30 6 5 A1 A3 A24 A25 K29 L A A4 L33 L10 X19 X16 K22 L23 9 A8 K29 6 L12 A12 A11 X28 L A X24 X25 9 A8 A4 L10 K22 L23 X17 X19 N C α−helical-Loop タンパク質−タンパク質相互作用阻害 抗G-CSF受容体・マイクロ抗体（抗リューマチ薬） 抗ヒトIgG-Fc・マイクロ抗体（免疫不全治療，抗体精製） 抗TNF-α・マイクロ抗体（抗リューマチ薬） 抗血管内皮細胞増殖i因子（VEGF）・マイクロ抗体（抗がん薬） 抗キナーゼ・マイクロ抗体（抗がん薬：オーロラA, B） 抗hDM2・マイクロ抗体（抗がん薬：p53類似ペプチド）次世代抗体医薬：立体構造規制ペプチド・ライブラリーによる分子標的ペプチド（マイクロ抗体）の開発 次世代抗体としての可能性 安定性：マウス血清中半減期 15.25日 抗原性：なし 細胞膜透過性：あり 表層提示ライブラリーによるスクリーニングシステムの開発 酵母表層提示ライブラリーの構築: 2 X 106 本シーズの応用 次世代抗体医薬 診断薬 タンパク質アフィニティー担体本技術に関する知的財産権１）特願２０１０－１０５５８１「環境ペプチド」２）特願２０１２－１３９２４３「抗腫瘍ペプチド化合物」３）特願２０１２－１９０５５１「VEGF結合性ペプチド」  出願人：大阪府立大学  代表発明者：藤井郁雄お問い合わせ先公立大学大阪府立大学地域連携研究機構産学官研究連携推進センター知的財産マネジメントオフィス菅谷正ＴＥＬ：072-254-9317 ＦＡＸ：072-254-9849 e-mail：[email protected]