新製品のご紹介簡単・迅速・高感度にマイ・高感度にマイコプラズマを検出 !! MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit Code FL071 10 回用 Code FL072 25 回用 Code FL073 100 回用 ¥20,000 ¥38,000 ¥95,000 Cambrex 社の製品です。 ● 20 分以内に検出が可能。 ● サンプルに試薬を添加し、ルミノメーターで測定するだけ。 ● すべてのマイコプラズマ属が検出可能。 MycoAlertTM アッセイマイコプラズマは培養細胞や培地などの汚染菌としてよく PCR 増幅知られ、汚染率は15%以上であることを示唆する研究もあります。蛍光染色法マイコプラズマの感染は、細胞の増殖速度を低下させるとともに、細胞機能に深刻な変化をもたらします。例えば、細胞の 14 – 21 Days 培養法遺伝子発現に大きな影響をもたらすことが知られており、数百個の遺伝子の発現パターンが変化したという報告 1）もあり 0 1 3 4 5 6 Time（ hours）ます。このように、マイコプラズマの感染は実験結果に多大な影響を及ぼすため、その感染の有無を知ることは重要です。 2 図1 種々の検出法で要する検出時間の比較最小の原核生物であるマイコプラズマは、通常のフィルターを通り抜け、またほとんどの抗生物質に抵抗性があるため、ルシフェラーゼ発光反応によって検出します。発光検出はル除去することが困難です。そのため、細胞の継代ごとにマイミノメーターを用いて行います。コプラズマの検査を行い、早急な処置を行うことが必要不可欠です。従来のマイコプラズマ検出法では、判定までに数時間∼数ルシフェラーゼ −−→ ATP ＋ルシフェリン＋ O2 −−−−−− Mg2＋オキシルシフェリン＋ AMP ＋ PPi ＋ CO2 ＋光日を要しましたが、本製品では 20 分以内で判定を行えます（Emission at 565 nm）（図 1）。しかも、2 種類の試薬を用いるだけで簡単に検出を実際には、MycoAlertTM Reagent をサンプルに加えて細胞を行うことができ、かつ高感度です（表 1）。溶解した後、MycoAlertTM Substrate を添加する前（A）と後 ■測定原理（B ）のサンプル中の ATP レベルを測定し（図 2 ）、その比本キットでは、マイコプラズマが特異的にもつ、ある種の酵（Reading B/Reading A）を求めます。サンプル中にマイコ素の活性を測定することで、生きたマイコプラズマを検出しプラズマが存在すれば、その比は 1.0 を大きく超えます。ます。この酵素がMycoAlertTM Substrate に作用すると、ADP 本キットを用いて測定し、その比を算出した例を表 2 に示しが ATP に変換されます。この生成したATP をルシフェリン／ます。表1 種々のマイコプラズマ検出法による検出感度の比較＊1（Cambrex 社データ）検体 MycoAlertTM 培養法蛍光染色法 A. laidlawii 0 20 200 20,000 200,000 − ＋＋＋＋ − ＋＋＋＋ − − ＋＋ − − ＋＋＋＋ M. hyorhinis 0 20 20,000 200,000 − − ＋＋ − − − ＋ − − − ＋ − ＋＋＋＊1：検体として、A. laidlawii と M. hyorhinis が感染した HepG2 細胞を用いた。陽性を＋、陰性を−と表示した。＊2： PCR は、35サイクル、1 ラウンドで行った（A 社キット使用）。nested PCR を行った場合、感度は上昇する。 34 PCR＊2 cfu/ml ● BIO VIEW No.45 ■プロトコール Luminescence（RLU） 10,000 本キットによる検出プロトコールの概要を図 3 に示します。 M. hyorhinis infected：B/A ratio 114 Uninfected control：B/A ratio ＜ 1 1,000 Reading A Reading B MycoAlertTM Assay Buffer を用いて、MycoAlertTM 100 Reagent および MycoAlertTM Substrate 溶液を調 10 製し、15 分ほど室温に放置する 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 d Time（minutes）図2 マイコプラズマ感染細胞と非感染細胞を検体とした場合の発光反応のキネティクスマイコプラズマ感染細胞の場合では、MycoAlertTM Substrate の添加により発光が増大し、Reading B/Reading A 比が1 を大きく超える。一方、非感染細胞の場合では、その比が 1 を大きく超えることはない。表2 MycoAlertTM アッセイによるマイコプラズマ感染細胞と非感染細胞の判別例サンプルに MycoAlertTM Reagent 溶液を添加し、 5 分間放置する d ルミノメーターで発光を測定（Reading A） d MycoAlertTM Substrate 溶液を添加し、細胞株感染細胞 K562 A549 U937 HepG2 非感染細胞 HL60 COS -7 Reading B/Reading A 比 123.26 4.10 8.26 1.27 ＊判定陽性陽性陽性ボーダーライン、 24 時間後に再テスト 10 分間放置する d ルミノメーターで発光を測定（Reading B） d Reading B / Reading A の比率を求め、サンプル中のマイコプラズマの有無を判定する 0.72 0.46 陰性陰性図3 本キットによるマイコプラズマの検出プロトコール＊：比率が1.0 をわずかしか超えていない場合は、24∼48 時間後に再テストを行い、比率が増加するか否かを確認する。【参考文献】 1）Miller, C. J. et al. : Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles.（2003）BioTechniques 35, 812-814. ■性能感度：PCR 法、蛍光色素法で偽陰性となるサンプルでも、検出可能。検出限界：50 cfu/ml 以下検出可能な菌：Mycoplasma 、Acholeplasma 、Ureaplasma なお、酵母、大腸菌を検出することはない。 BIO VIEW No.45 ● 35