148 モダンメディア 54 巻 5 号 2008［医学検査のあゆみ］医学検査のあゆみ ─ 11 次世代の結核感染診断法とその諸課題 Next generation of Diagnosis for tuberculosis infection はら結核予防会結核研究所抗酸菌レファレンスセンター免疫検査科だのぶゆきひぐちかずえ原田登之：樋口一恵 Nobuyuki HARADA 要旨 Kazue HIGUCHI はじめに最近これまでの結核感染診断法であったツベルク結核感染、特に潜在性感染を診断する方法は、ごリン反応（ツ反）よりも、特異度の高い診断法が開発く最近まで唯一ツ反のみであった。ツ反は PPD 投され市販されるようになった。これらの診断法は、結与による遅延型過敏反応、すなわち細胞性免疫反応核菌特異抗原 ESAT-6 と CFP-10 によりリンパ球をを観察するものであるが、ツ反の感度は良好なもの刺激後、産生されるインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）の、PPD が BCG や非結核性抗酸菌の持つ抗原と類量を測定することにより結核感染を診断する方法で似性が高いため、BCG 接種や非結核性抗酸菌感染あり、IGRAs（Interferon-Gamma Release Assays）によってもツ反は陽性を示すことがあるという特異と呼ばれている。現在市販の診断試薬としての度の点で問題を持っていた。 IGRAs は 2 種類あり、1 つは全血を用いるクォンティ ® しかし、近年の結核菌遺伝子および抗原解析の進 ® 展に伴い、BCG 接種やほとんどの非結核性抗酸菌 TB-2G と呼ばれる。以下 QF T-2G）である。もう 1 感染の影響を受けない結核感染診断法が開発されつは現在日本では診断試薬として認可されていなた。これらは、結核菌特異抗原 ESAT-6 と CFP-10 フェロン -TB Gold（日本ではクォンティフェロン ® いが、精製リンパ球を用いる T-SPOT .TB（以下 T- の一部に相応する合成ペプチドによりリンパ球を刺 SPOT）がある。激後、産生される IFN-γ量を測定することにより結日本では QFT-2G が診断試薬として認可されてお核感染を診断する方法であり、IGRAs と呼ばれていり、昨年の新たな接触者健診のガイドラインにおいる。これら ESAT-6 と CFP-10 は BCG やほとんどのて積極的に使用することが推奨された。さらに、非結核性抗酸菌に存在しない抗原であるため、ツ反 QF T-2G の次世代（仮に QF T-3G と呼ぶ）のものがと比較し特異度が格段に良くなっている。IFN-γ産すでにヨーロッパ等で使用されており、米国では昨生は細胞性免疫反応の一側面であるため、IGRAs も年 FDA により承認されている。また、T-SPOT は結核菌に対する抗原特異的な細胞性免疫反応を観察 QFT-2G より感度が高いことが報告されており、今しているといえる。後日本での診断試薬として認可が待たれる。本稿に現在、市販の診断試薬としての IGRAs は 2 種類おいては、この QFT-3G と T-SPOT の原理、およびあり、1 つは日本で診断試薬として認可されているわれわれがこれまでに得た QF T- 2G に関するいく全血を試験検体として用い、産生 IFN-γ量を ELISA つかの研究成果について解説する。法により定量する QFT-2G である。もう 1 つは現在日本では診断試薬として認可されていないが、精製リンパ球を用い、IFN-γ産生細胞数を ELISPOT 法結核予防会結核研究所抗酸菌レファレンスセンター免疫検査科 0204 - 8533 東京都清瀬市松山 3 - 1 - 24 Immunology Division, Mycobacterium Reference Centre, The Research Institute of Tuberculosis, Japan Anti-Tuberculosis Association. (3-1-24, Matsuyama, Kiyose, Tokyo) （ 14 ） 149 により定量する T-SPOT がある。これらの診断法はさらに、QF T-3G には結核菌特異抗原 ESAT-6 と共に高感度・高特異度を持つが、開発されてから間 CFP-10 に加え、もう 1 つの結核菌特異抗原としてもないため現在でも方法論的に進歩している状況で TB7.7（Rv2654）の合成ペプチドが新たに加えられあり、特に QFT-2G については次世代の QFT-3G がている。 3）すでに欧米等で使用されている。また、これら診断以上のような理由により、QFT-3G は QFT-2G よ法の特性についても、多くの解明されるべき点が残りも感度が高いと考えられる。実際、われわれの臨されている。床試験により、QFT-3G は QFT-2G よりも感度が高本稿においては、この QFT-3G と T-SPOT の原理、く、かつ高特異度は維持していることが示されてい 4）およびわれわれがこれまでに得た QFT-2G に関するる。今後、早急に QFT-3G が認可されることが期いくつかの研究成果について解説したい。なお、QFT- 待される。 1） 2G の詳細については前稿が参考になるであろう。 Ⅱ. T-SPOT Ⅰ. QFT-3G T-SPOT の原理は、エリスポット（ELISPOT）法昨年 9 月に発行された新しい接触者健診のガイドを用いた診断法である。エリスポット法の正式な呼 2）ラインにおいて、QFT-2G を積極的に使用するこび方は、Enzyme -Linked ImmunoSpot 法であり免疫とが推奨されたため、QFT-2G 検査は今後急速に広のさまざまな研究面で使われている。一般的には特まることが予想される。しかし一方で QFT-2G は、定のサイトカインを産生する細胞をスポット（点）採血から血液刺激までの時間に制限があり、実施がとして可視化し、サイトカイン産生細胞数を測定す困難な地域も多数存在する。る方法であり、このエリスポット法を基礎とした結このような検体搬送上の問題点を克服するものと核感染診断法 T-SPOT が英国で開発され、現在、主して、QFT-3G が期待される。QFT-3G の大きな改にヨーロッパを中心に使用されている。T-SPOT の善点は、採血後直ちに血液刺激が可能になっている感度は、QFT-2G あるいは QFT-3G より高いとすることである。図 1 に示すように、QFT-3G では専用報告が一般的である。 5）の 1ml 用採血管 3 本（陰性コントロール、陽性コン T-SPOT は、QF T-2G で使用されているのと同じトロール、抗原）がセットになっており、採血管内結核菌抗原 ESAT-6 と CFP-10 の一部に相応する合にあらかじめ刺激抗原が添加されている。このため、成ペプチドを用いているが、使用部位およびペプ採血後十分混和し培養器に入れることにより抗原刺チドの長さは QFT-2G とは異なっている。検査法は、激が開始される。ポータブルの培養器を用いれば、 QF T-2G と比較しより高度な技術と設備を要する。採血場所において血液培養が可能になる。検査法の概略は図 2 に示すように、へパリン採血し Stage 1: 血液培養と回収陰性陽性対照 ESAT-6 ＋ CFP-10 ＋ TB7.7 血液1mL採血 37℃で16∼24時間培養 COLOR Stage 2: IFN-γ ELISAと解析 TMB サンドイッチELISA法によるIFN-γの測定解析ソフトによる結果の計算と報告書の印刷図 1 QFT-3G の原理（ 15 ） 5分間遠心. IFN-γは冷蔵庫で2カ月安定. 150 密度勾配遠心 PBMCの培養培養抗原刺激（ESAT-6/CFP-10） PBMCの分離洗浄後、標識 2次抗体添加コロニーカウンターによる計測発色 IFN-γ産生細胞の位置に色素が着色図 2 ELISPOT の原理た血液より末梢単核球（Peripheral Blood Mononu- 58 項目もの研究課題を提唱している最近の総説が clear Cells ; PBMCs）を精製し、一定数の PBMCs あり、また本総説には IGRAs に関する多数の論文を抗原で刺激培養する。エリスポット用の 96 ウエが引用されており参考になるであろう。 6）ル培養プレートは、底面が PVDF 系のメンブレンで現在、われわれもいくつかの課題について研究を構成され、ヒト抗 IFN-γ抗体があらかじめ吸着され行っており、これまでに得られた成果を紹介したい。ている。このため、培養中に IFN-γ産生細胞から放出される IFN-γは、周辺部で直ちに抗体に結合する。 1. 結核感染後 IGRAs が陽性になるまでの期間培養後、分泌された IFN-γを染色することで、IFN- 結核に対する細胞性免疫反応である従来のツ反 γ産生細胞の存在した場所をスポットとして可視化が、結核感染後陽転するまでに 8 ∼ 10 週必要であする。このスポット 1 個が、IFN-γ産生細胞 1 個にるとされており、やはり細胞性免疫反応である IGRAs 相当すると考えられる。染色後、スポット数をスもこの考えに準じている。したがって、現状の接触ポットリーダーにより計測し、規定の判定基準によ者健診では、最終接触後 8 ∼ 10 週で QF T-2G 検査り結核感染の診断を行う。より詳細は、以下のインを実施することが推奨されている。われわれは、結核患者との接触者に対し経時的にターネットサイトhttp://www.oxfordimmunotec.com/ QFT-2G 検査を行った結果、最終接触後 3 カ月以降が参考になるであろう。に陽性になった者がいなかったことより、QFT-2G 検査の最適な実施時期は最終接触後 3 カ月である可 Ⅲ. IGRAs の研究課題 7）能性を示唆した。 IGRAs を用いた研究は現在活発に行われており、しかし、実際の接触状況は多くの場合が最終接最近数年で報告が多数なされている。ほとんどの論触以前にも長期間の接触があるため、現状の接触者文は、IGRAs はツ反と異なり BCG 接種や非結核性健診における QFT-2G の検査時期は妥当と考えられ抗酸菌感染の影響を受けること無く、結核感染を高る。しかし、接触が短期間で時期も特定しうる場合い感度と特異度で診断できる方法であると報告しては、最終接触後 3 カ月程度の QFT-2G 検査実施も選 5）択肢の 1 つかもしれない。いる。しかし、前述のように IGRAs は新しい診断法であるため、診断特性上解明すべき課題が多数存在す今後もこのようなデータを蓄積することにより、より的確な診断時期の設定が可能であろう。る。これらの課題をまとめたものとして、Pai らが（ 16 ） 151 100 100 ESAT-6 2. 免疫脆弱者に対する IGRAs の適応小児や HIV 感染者等の免疫脆弱者に対する IGRAs ＋に得た結果では、HIV 感染者であっても CD4 細胞がある程度保たれておれば QFT-2G 検査による診断 8）は可能であることが示唆されている。また、小児においても結核発病の診断には QF T9, 10）。 10 IFN-γ production（IU/ml） IFN-γ production（IU/ml） 10 の使用も多数報告されている。われわれがこれまで 2G 検査は有効であることも明らかになっている CFP-10 1 1 0.1 0.1 0.01 ただし、小児、特に 0 歳児における潜在感染に対する QFT-2G 検査の感度は、必ずしも高くないことも 0.01 11）示されており、今後の研究課題と思われる。 0.001 Before 3. IGRAs の結核治療モニターへの適応 After Before After 図 3 潜在性結核感染症治療前後における QF T-2G 応答値変化結核化学治療や潜在性結核感染症治療（予防内服）により IFN-γ産生応答が低下することが報告されており、IGRAs が結核治療モニターとして使用でき ESAT-6に対する応答（左）の幾何平均は、予防内服前 1.398で内服後は0.362となり有意差が見られた（P ＜0.001）。同様にCFP-10のそれは、0.312から0.120と有意に低下してい 14）た（P ＜0.001）。る可能性が示唆されている。IGRAs におけるリンパ球刺激時間は 24 時間以内であり、この期間中にのように、IGRAs は治療終了後も陽性反応を示す場 IFN-γを産生するのはエフェクター T 細胞であり、合が多いため、IGRAs における陰性化を治療成功のこのエフェクター T 細胞は抗原の減少に伴い、やは指標とすることは難しいと考えられる。ただし、結 12）り減少すると考えられている。すなわち、結核化核化学治療や潜在性結核感染症治療により IFN-γ産学治療や潜在性結核感染症治療による IFN-γ産生応生応答が低下することは通常観察されることより、答の低下原因は、治療による結核菌数の減少により薬剤耐性菌に対する治療の効果指標として活用でき IFN-γ産生エフェクター T 細胞が減少するためと解る可能性は考えられる。釈される。われわれも QF T-2G 検査に対する潜在性結核感 4. IGRAs による結核発病者の予測染症治療の影響を検討しているが、治療終了後の上記の内容とも関連するが、エフェクター T 細胞数陰性化率は必ずしも高くない。接触者健診 2 事例にが抗原量、すなわち菌量と相関するならば、IFN-γ ついて、潜在性結核感染症治療前に QF T-2G 陽性産生応答が強いほど結核菌数が多いと考えられ、発者および疑陽性者であった接触者を対象に、治療病に移行する可能性が高いと想像される。ESAT-6 終了直後に QF T-2G 検査を実施した結果、全体的を発見した Andersen らは、このような考えに基づな IFN -γ産生応答には有意な低下が見られたものき IGRAs による将来の結核発病予測の可能性を提の、QF T-2G 検査における陰性化率は 20 ∼ 25%で唱している。 15） 13, 14）あった（図 3）。われわれは、ある接触者健診において、健診時点さらに、治療終了後 1 年から 1 年半に再度 QF T- ですでに発病者が多数見られた事例を経験したが、 2G 検査を行ったが、治療終了直後に比較し有意なこの集団における発病者は接触から健診時点まで短低下は認められなかった。これらの結果は、潜在性期間であったため発病直後と考えられた。本事例に結核感染症治療をしたとしても完全に結核菌は死滅おける発病者と潜在的感染者の両者の IFN-γ産生応していないことを示唆していると考えられる。また、答値を比較した結果、発病者の平均 IFN-γ産生応答結核化学治療においても、QFT-2G 検査の陰性化率値は有意に潜在的感染者のそれより高いことが示さは潜在性結核感染症治療より高いものの、われわれれた（図 4）。 13）が行った初期の結果では約 50%程度であった。こ（ 17 ） 16）すなわち、IFN-γ産生応答値が高いほど発病のリ 152 100 おける診断試薬としての承認も待たれる。 IFN-gamma production（IU/ml）これら IGRAs の開発から現在の臨床応用までの期間は短いため、診断特性において解明されるべき課題は多数残されているが、IGRAs の現在の急速な 10 使用頻度を見ると、今後多くの課題が解決されることが期待される。文献 1 1 ）原田登之：モダンメディア 52 : 217-221, 2006. 2 ）財団法人結核予防会：改正感染症法に基づく結核の接触者健診の手引きとその解説. 2007. 0.1 Active TB 3 ）Aagaard C, et al.: Mapping immune reactivity toward LTBI Rv2653 and Rv2654 : two novel low-molecular-mass antigens found specifically in the Mycobacterium tuberculosis 図 4 QF T-2G 応答値と発病の相関 complex. J. Infect. Dis. 189 : 812 - 819, 2004. Active TBは発病直後、LTBIは潜在性感染を表し、 Geometric mean±SD for“Active TBの幾何平均±標準偏差は3.65±3.23（n＝35）であり、潜在性感染のそれは2.02±2.80（n＝76）となり、統計的有意差が見ら 16）れた（P＝0.013）。 4 ）Harada N, et al.: Comparison of two whole blood interferon γ - assays in tuberculosis patients and healthy controls. J. Infection. 56 : 348 - 353, 2008. 5 ）Menzies D, et al.: Meta-analysis : new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection : areas of uncertainty and recommendations for research. Ann. Intern. Med. スクも高いという相関が見られたが、一方では発病 146 : 340-354, 2007. 者でも IFN-γ産生応答値が低い者もいれば、IFN-γ 6 ）Pai M, et al.: T-cell assays for the diagnosis of latent 産生応答値が非常に高い潜在的感染者もいることよ tuberculosis infection : moving the research agenda for- り、発病リスクの基準値というものを設定すること ward. Lancet Infect. Dis. 7 : 428 - 438, 2007. 7 ）吉山崇ほか：接触者検診のためのクォンティフェロンは現状では困難のように思える。 ® TB-2G 検査のタイミングについて. 結核 82 : 655 -658, 結核発病に関しては、IFN-γ産生応答以外の宿主 2007. の遺伝的バックグラウンドも考慮する必要もあると 8 ）藤田明ほか： HIV 感染者の結核感染診断に対するクォ想像され、将来これらのファクターを加味して発病ンティフェロン TB-2G の有用性に関する検討. 結核, 82 : 380. 2007. リスクの基準値が設定できることが期待される。 9 ）森雅亮ほか：小児結核における結核菌感染診断用インターフェロン-γ測定試薬の有用性についての検討. 感染 5. IGRAs のその他の応用例症誌 79 : 937-944, 2005. IGRAs を血液以外の検体に用いた結果も報告されている。Ariga ら 17）は、QF T-2G 検査を胸水検体に 10）原田登之ほか：小児における QFT-2G の使用例. 結核 82 : 354. 2007. 11）徳永修ほか：小児結核感染診断におけるQuantiFERON 適応し、好成績を報告している。また、T-SPOT でも同様に胸水検体に適応した結果、感度良く結核感 TB-2G の有用性に関する検討. 結核 82 : 355. 2007. 12）Lalvani A, Counting antigen-specific T cells : a new approach for monitoring response to tuberculosis treat- 18）染を診断できることが報告されている。今後、このような知見が蓄積されることにより、IGRAs の応 ® ment ? Clin. Infect. Dis. 38 : 757-759, 2004. 13）樋口一恵ほか：結核化学治療および予防内服終了者に用範囲が広がることが期待される。 ® おける QuantiFERON TB-2G のパフォーマンス. 結核 80 : 332. 2005. 14）Higuchi K, et al.: Effect of Isoniazid Chemotherapy for おわりに Latent Tuberculosis on Whole Blood Interferon-γ Responses. Respirology. 13 : 468 - 472, 2008. QFT-2G の検体搬送の難点を解決できる QFT-3G 15）Andersen P, et al.: The prognosis of latent tuberculosis : can disease be predicted ? Trends Mol. Med. 13 : 175 -182, の早期の承認が待たれる一方で、QFT-2G では検出困難な免疫不全症（エイズ等）患者や小児などでの 2007. 16）Higuchi K, et al.: Relationship between whole blood inter- 結核感染診断で役立つと思われる T-SPOT の日本に（ 18 ） feron-gamma responses and the risk of active tuberculo- 153 sis. Tuberculosis 88 : 244 - 248, 2008. 18）Losi M, et al.: Use of a T- cell interferon-gamma release 17）Ariga H, et al.: Diagnosis of active tuberculous serositis by antigen-specific interferon-gamma response of cavity fluid cells. Clin. Infect. Dis. 45 : 1559 -1567, 2007. （ 19 ） assay for the diagnosis of tuberculous pleurisy. Eur. Respir. J. 30 : 1173 -1179, 2007.