Problematiche microbiologiche nei prodotti della

Problematiche microbiologiche nei Problematiche
microbiologiche nei
prodotti della pesca e nei molluschi bivalvi Luigi Lanni
Procedure per un efficace controllo di filiera in sicurezza alimentare: i prodotti della pesca ed i molluschi bivalvi
Sessione 2
Sessione 2 Valmontone 9 ottobre 2014
‐
Panoramica •Approccio utilizzato
pp
•Tipologia di matrici considerate
•Microrganismi correlati alla normativa comunitaria
• Altri microrganismi
Altri microrganismi
•Elementi discriminanti per la ricerca di un microrganismo
•Considerazioni pratiche durante la produzione: (F.B.O. ‐ LAB ‐ CA) Problematiche microbiologiche ….
Molluschi bivalvi
Prodotti della pesca
Microrganismi
E. coli
Stafilococchi coag +
Salmonella spp.
Vibrio spp.
spp
Listeria monocytogenes
HAV
NoV
Enterobatteri
C.M.T
LAB
L.A.B.
C.P.T
Lieviti Muffe Approccio utilizzato
Legislazione
Microrganismi
Sicurezza
Processo
Batteri
Potenzialmente patogeni
Indicatori accessori
Altri microrganismi
Virus
Fonti bibliografiche
Fonti bibliografiche
Matrice di interesse
Matrice di interesse
• Habitat
Acquatico
Preliminare
Ambientale (senso lato)
• Fattori incidenti
Sopravvivenza
Sopravvivenza Crescita
Crescita Intrinseci
A i l /
Animale/umano (reservoir)
(
i)
E i
Estrinseci i
• in relazione alle fasi di filiera
Fase di filiera
Prima e durante la raccolta/cattura
Nutrienti
pH
p
Antimicrobici
aw
Umidità rel.
idi à l
Temperatura
Microrganismi più comuni
Salmonella, E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
parahaemolyticus Vibrio
vulnificus, Norovirus (Epatite A)
Successivi alla raccolta e alla raccolta e Listeria monocytogenes, Clostridium
Listeria monocytogenes Clostridium
durante il processo di botulinum, Staphylococcus aureus, produzione
Epatite A Rotavirus (Salmonella)
Epatite A, Rotavirus
Considerazioni specifiche in relazione a specifici prodotti
• Ulteriori considerazioni legate all
Ulteriori considerazioni legate all’impresa
impresa
Elementi
fattori da considerare
Tecnici Qualità intrinseca del prodotto (caratteri organolettici),
sicurezza
i
materie
i prime;
i
probabili
b bili alterazioni;
l
i i tecnologie
l i
utilizzate; confezionamento; durabilità nel tempo, ecc
Gestionali
Sistema
Si
t
adottato;
d tt t
clienti;
li ti promozione;
i
consegna; fatturazioni
f tt
i i e
pagamenti, ecc.
Rifiuti e gestione delle acque, contaminazioni crociate,
Ambientali
bi
li
ecc.
• Microrganismi e probabilità di riscontrarli nella matrice
Livello di contaminazione
Contaminazione 5 cell/kg omogenea
1 cell/kg Contaminazione 5 cell/kg es: 1% del lotto
es: 1% del lotto eterogenea
eterogenea 104 cell/kg Numero di
Numero
di
campioni (random)
Probabilità (*)
Probabilità (*)
10 71% 10 22% 10 <2% 10 <15% (*) Influenza del metodo: assumendo che la rilevabilità del metodo sia il 100%
(realmente molti sono <90%)
Bassa prevalenza può essere influenzata dal criterio e modalità di
Bassa prevalenza può essere influenzata dal criterio e modalità di campionamento?
Piano di campionamento a 2 classi
Piano di campionamento a 3 classi
Microrganismi correlati alla normativa comunitaria
Escherichia coli
Escherichia coli
Regolamento 2073/2005
limiti
U.C.
C
Applicabilità
(1.25)
(2.4.1)
≤ 230 MPN/100g
1
5
0
2
L.B.M.
B.M./Crust. 1/g
10/g
•Indicatore di contaminazione fecale Habitat: animale/umano
•Valutazioni indirette sulla zona di produzione (zona A)
•Valutazioni indirette sul processo di depurazione (zona B)
• Valutazioni indirette sulla conservazione durante le diverse fasi di commercializzazione odata di confezionamento otrasporto
oconservazione (piattaforma, dettaglio)
(
f
d
l )
oesposizione ⇔ conservazione (dettaglio)
• Valutazioni su materia prima in ingresso negli stabilimenti di
trasformazione
f
i
‐ tecnologia
l i applicata
li
– garanzie
i su prodotto
d
fi i
finito
Shucking
Freezing
Allegato
g
III, Capitolo
, p
II , Punto
,
A5 Trattamenti termici
Sterilizzazione
Bollitura
Cottura non a vapore
Cottura a vapore
(a)
(bi)
(bii)
(biii)
EU
Criteri di conformità
Regolamento 854/2004 (matrice mollusco 1UC) → 853 → 852/2004
852/2004 art 1(f) → 2073/2005
1(f) → 2073/2005
PAESI TERZI Zone di produzione A (matrice acqua)
Regolamento 2073/2005
limiti
U.C.
C
Applicabilità
(1.25)
≤ 230 MPN/100g
1
0
L.B.M.
P bl i di
Problemi di scambi commerciali ‐
bi
i li doppio sistema di controllo export
d
i it
di
t ll
t
CODEX Stan 292‐
008
2008
limiti
Escherichia coli m=230
U.C. C
5
M=700
MPN/100g MPN/100g 1
• Aumento numero di unità campionarie →
+ prove o riduzione del numero di
campioni ?
• Interpretazione dei risultati ? Diversi Limiti
• Quantitativo di prodotto prelevato ?
• Differente
Diff
t
approccio
i
i
in
produzione
d i
primaria ?
Applicabilità
This standard applies to live
bivalve molluscs and to raw
bivalve molluscs that have
been shucked and/or frozen,
and/or processed to reduce or
limit target organisms while
essentially
retaining
the
sensory characteristics of live
bivalve molluscs.
Salmonella
Regolamento 2073/2005
/
limiti
U.C.
C
Applicabilità
(1.16)
(1 17)
(1.17)
assente/25g
assente/25g
5
5
0
0
B.M./Crust. LBM
L.B.M.
•Indicatore di contaminazione fecale Habitat: animale/umano
•Contaminazione materia prima (L.B.M.) + cross contaminazioni
•Valutazioni indire e sull’eﬃcacia del processo (eﬃcienza ≠ numerica) o depurazione
o cottura
•Bassa prevalenza
CODEX Stan 292‐2008
CODEX Stan
292 2008 limiti
Salmonella
assente/25g
UC C
U.C.
Applicabilità
5
L.B.M./B.M raw
0
Stafilococchi coagulasi positivi
Regolamento 2073/2005
/
limiti
(2.4.1)
100
U.C.
1000ufc/g 5
C
Applicabilità
2
B.M./Crust. •Indicatore di contaminazione
Habitat: animale/umano
•Cross contaminazioni durante la manipolazione
•Valutazioni
Valutazioni GHP GHP
•Valutazioni GMP Trattamenti termici
Processo applicato
Sterilizzazione
Bollitura
Cottura non a vapore
Cottura a vapore
Successive manipolazioni
(a)
(bi)
(bii)
(biii)
Microrganismi non correlati alla normativa comunitaria
Microrganismi
non correlati alla normativa comunitaria
(interesse epidemiologico)
(26) I criteri microbiologici fissati nel presente regolamento
devono poter essere riveduti e modificati, se necessario, per
tenere conto dell’evoluzione nei settori della sicurezza
alimentare e della microbiologia degli alimenti, ossia dei
progressi
scientifici,
tecnologici
e
metodologici,
dei
cambiamenti nei livelli di prevalenza e contaminazione e nella
percentuale di consumatori sensibili, nonché degli eventuali
risultati
i lt ti che
h emergono dalla
d ll valutazione
l t i
d i rischi.
dei
i hi
(11) Il 19 e 20 settembre 2001 il CSMVSP ha adottato un parere
sull Vibrio
b vulnificus
l f
e sull Vibrio
b parahaemolyticus,
h
l
concludendo
l d d
… omissis
(12) Il 30 e 31 gennaio 2002 il CSMVSP ha emesso un parere sui
virus Norwalk‐simili (NLV, Norovirus), concludendo che gli
indicatori fecali convenzionali non sono affidabili … omissis
(27) In particolare,
particolare è opportuno che i criteri per i virus patogeni
nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d’analisi
sono stati sufficientemente messi a punto.
Vibrio
Vibrio spp. Patogeni
•circa 70 specie
p
Habitat primario
• V. cholerae Ubiquitario di acque
15 C)
• V
V. parahaemolyticus parahaemolyticus calde ((>15°C)
Acque marine
• V. vulnificus
Livelli di rischio
>102‐103 cfu/g in LBM;
>10
104‐10
108 cfu/g apparato
cfu/g apparato
gastroent. LBM
• V.
V alginolyticus
l i l ti
•suscettibilità alla salinità
•elevata sensibilità al calore (V.p. → D50‐60= 30”‐80”)
•capacità di moltiplicazione nei molluschi in fase di stoccaggio a T •capacità
di moltiplicazione nei molluschi in fase di stoccaggio a T
non idonea ostrica target maggiormente a rischio
target maggiormente a rischio
•ostrica
Operazioni
Operazioni: p
: scelta, lavaggio, pulizia, eviscerazione, dissanguamento
passaggio dei microrganismi al tessuto muscolare
replicazione batterica
(influenza del controllo termico e delle reazioni autolitiche) •contaminazioni crociate in caso di lavorazioni a bordo
• tempo di moltiplicazione molto veloce ( 12’‐18’ a 30°C)
Metodiche
Colturali
ricerca (prearricchimento + isolamento) & identificazione biochimica
Metodiche combinate
ricerca & identificazione biochimica + caratterizzazione molecolare ricerca
(prearricchimento + isolamento) + identificazione molecolare
ricerca (prearricchimento) + identificazione molecolare
Molecolari
ricerca target molecolare (sequenza DNA/RNA) direttamente da matrice
ISO:
A/P
NMKL:
A/P + En.
Metodi normati
Metodi di normatii e fasi e procedurali
f i
d li
ISO 8914:1990
Vp
ISO/TS 21872 1: 2007
ISO/TS 21872‐1: 2007
Vp+Vc
ISO/TS 21872‐2: 2007
altre specie
metodo 156 (1997)
d
(
)
Pathogenic Vibrio
h
b species
Schema comune
a) prearricchimento
a)
prearricchimento
(APWs + eventuale 2°
terreno)
colonie verdi
b) isolamento (TCBS + eventuale 2° terreno)
colonie gialle
V. parahaemolyticus
V Vulnificus
V. Vulnificus
V. mimicus
Plesiomonas spp.
V. Cholerae
V. alginolyticus V fluvialis
V. fluvialis
Aeromonas spp.
c)) identificazione ((test p
preliminari es. Ossidasi,, Fermentazione del
glucosio, produzione H2S e gas)
Salinità
V. cholerae
V. mimicus
V. vulnificus
f
V. parahae‐
p
molyticus
V. alginoly‐
g y
ticus
0%
+
+
‐
‐
‐
3%
+
+
+
+
+
6%
‐
‐
+
+
+
8%
‐
‐
‐
+
+
10%
‐
‐
‐
‐
+
• ≈ solo 1‐2% degli isolati ambientali sono patogeni
g
p g
5 c.f.u.) • patogenicità V.p. K+ (≈10
(
)
oemolisina termostabile diretta (TDH) oemolisina correlata termostabile (TRH)
li i
l
bil (
)
oemolisina termolabile (TLH)
Risultato → assenza/presenza
/p
Livelli di rischio ?
Metodi non Metodi non normati
normati e possibili prospettive
•
q rtPCR
•
•
sensibilità: 102‐104 cfu/g
MPN‐(rt)PCR
Colony hybridization
Principio
• crescita su terreno non selettivo / parzial. Selettivo • trasferimento delle colonie su filtro
• lisi delle colonie e legame covalente del DNA al filtro
ibridazione DNA – sonda specifica
sonda specifica
• ibridazione DNA • rilevazione colorimetrica della sonda
Differenziare, enumerare Vibrio
Differenziare, enumerare Vibrio parahaemolyticus identificandone i fattori di patogenicità
identificandone i fattori di patogenicità
Virus enterici ‐ Patogeni più comuni trasmessi con gli alimenti
NoV
US: 66.6% dei casi di MTA vs 9.7% della Salmonella
EU patogeni
EU:
t
i a trasmissione
t
i i
alimentare
li
t
più
iù importanti
i
t ti sia
i per numero
di epidemie che per numero di soggetti colpiti
Alert
Border rejecton
Information Information
for attention
2013
10
5
14
2012
6
0
2
2011
0
0
1
2010
7
1
0
2009
0
1
0
Year
Method
ISO/TS
15216 Horizontal method for determination of HAV and Nov
‐1 method for quantification
‐ 2 method for qualitative detection
TARGET
L.B.M.
‐ All/B.N. , specie, metodi ‐ ubicazione ‐ modalità di consumo
modalità di consumo
( ) Il p
(21)
produttore o il fabbricante di un
prodotto alimentare è tenuto a decidere
se il prodotto è pronto ad essere
consumato tale e quale,
quale senza
doverlo cuocere o sottoporre ad altri
processi per garantirne la sicurezza e il
rispetto
i
d i criteri
dei
i i microbiologici
i bi l i i . Omissis
i i
le istruzioni per l’uso di un prodotto
alimentare devono obbligatoriamente
essere riportate sull’etichetta quando
la loro omissione non consenta
all’acquirente
all
acquirente di fare un uso appropriato
Filtrazione e concentrazione
mitili 1‐4 L/h; ostriche 20‐40 L/h
Concentrazione dei patogeni dalle acque circostanti virus: 2 log
virus: 2 log
Allegato III, Capitolo II , Punto A5 Sterilizzazione
Trattamenti termici
Bollitura
Cottura non a vapore
Cottura a vapore
(a)
(bi)
(bii)
(biii)
• nuove ISO consentono la rilevazione e/o la quantificazione
• prevalenza nei campioni e severità della malattia supportano
l’adozione un criterio presenza/assenza per HAV
• prevalenza, livelli di contaminazione e modalità di consumo
(crudo/cotto) supportano l’adozione di criteri differenziati per NoV
• dati epidemiologici e di monitoraggio non supportano (ancora)
l’adozione di criteri p
per virus diversi da HAV e NoV
Listeria Microrganismi correlati alla normativa comunitaria
Regolamento 2073/2005
limiti
U.C.
C
1.2
1 2 – 1.3
1.2 –
13
assente / 25g
100 ufc/g
100 ufc/g
5
5
0
0
Applicabilità
favorevoli*
favorevoli**
favorevoli
non favorevoli ***
pp
se il p
produttore non è in ggrado di dimostrare il non
* Si applica
superamento di 100 ufc/g durante il periodo di conservabilità.
**Si applica se il produttore dimostra il non superamento durante il
periodo
i d di conservabilità.
bili à
???
*** pH ≤ 4,4 o a w ≤ 0,92
pH ≤ 5,0
5 0 e a w ≤ 0,94
0 94
conservabilità inferiore a 5 giorni QUALE APPROCCIO
Stabilire la conservabilità e garantire i limiti a termine shelf life!!
Riferimenti e documenti
Progettazione dello studio
Valori di riferimento (normati, volontari)
Valori di riferimento (normati, volontari)
Parametri da misurare (es. pH, aw,sensoriali, TVBN, ecc) Costi Test di durabilità (Shelf life) ‐ Challenge test
Il Comitato Settoriale di Accreditamento dei Dipartimenti laboratori di
prova e laboratori di prova per la sicurezza degli alimenti ha deliberato,
riguardo ai test in oggetto, le seguenti decisioni:
Matrice
Alimenti pronti al consumo (RTE)
Determinazione
Listeria monocytogenes
(challenge test)
EN ISO 11290 2 accreditato
EN ISO 11290‐2 accreditato
Alimenti pronti al consumo (
(RTE)
)
Listeria monocytogenes
(test di durabilità)
EN ISO 11290‐2 accreditato
Metodo
AFSSA EU CRL for Listeria monocytogenes Vers
monocytogenes Vers 2 2008 ‐ cap 2 o 3
AFSSA EU CRL for
Listeria monocytogenes Vers
2 2008 ‐ cap 4
• riporti le informazioni previste dal documento AFSSA nei par. "Test
report " (2.2.10 / 3.2.11/ 4.5) nellʼapposito capitolo del rapporto di
prova "Pareri ed interpretazioni ‐ non oggetto dell'accreditamento
ACCREDIA“.
Esperienza teorico‐pratica
Listeria monocytogenes e dintorni
Premessa challange
Premessa challange test ‐
test ‐ conservabilità
Scopo deI challenge test
Scopo deI
challenge test
fornire informazioni sul comportamento, in determinate condizioni di
conservazione, di L. monocytogenes inoculata artificialmente in un
alimento.
li
A l
Analogamente
…….
Challange test: potenziale di crescita
•capacità del microrganismo di crescere nell’alimento ( δ )
•contaminazione artificiale ‐ modalità trasporto, distribuzione, stoccaggio
•riflettere
ifl
l condizioni
le
di i i che
h sii potrebbero
bb
verificare
ifi
nella
ll realtà
l à (filiera
(fili
post
primaria)
•( δ ) differenza tra log10 cfu fin e log 10 cfu iniz
δ > 0,5 log10 ufc/g, il prodotto è classificato come "Alimenti pronti che
costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes, diversi da quelli
destinati ai lattanti e a fini medici speciali " (categoria 1.2)
δ ≤ 0,5 log10 ufc/g, il prodotto è classificato come "Alimenti pronti che non
costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes, diversi da quelli
destinati ai lattanti e a fini medici speciali " (categoria 1.3),
Challange test: tasso di crescita massimo
•stima dei parametri di crescita del microrganismo (μ max)
•rapporto tra incremento del microrganismo dal t ‐1 al tempo t ed il
suo valore al tempo t‐1
Challange test
Fornire informazioni sul comportamento di un patogeno in un prodotto alimentare in determinate condizioni
in un prodotto alimentare in determinate condizioni
Studi di conservabilità
•valutazione
l
i
d ll crescita
della
i di L.
L monocytogenes neglili alimenti
li
i contaminati
i i
naturalmente durante lo stoccaggio in base alle condizioni
ragionevolmente
g
prevedibili. Analogamente
p
g
•più realistici rispetto a challange tests
•probabilità di contaminazione naturale del campione
•eterogeneità della contaminazione nel campione
•utilizzabili per patogeni qualora sia costante la loro presenza
Test di durabilità = Shelf life = conservabilità
Test di durabilità = Shelf
life = conservabilità
Shelf life
Valutazione della naturale composizione della flora batterica del
prodotto,, dei p
p
potenziali p
patogeni
g
derivanti da contaminazioni
accidentali e stabilirne la durabilità nel tempo
Se una relazione è stata lunga e difficile da seguire … mettiamoci anche nei panni di chi sta dall’altra
mettiamoci anche nei panni di chi sta dall
altra parte
parte
GRAZIE PER L’ATTENZIONE

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