Lezioni 1 e 2

CLASSICHE
GENETICA
BIOTECNOLOGIE
MODERNE
BIOLOGIA
CELLULARE
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
INGEGNERIA GENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOCHIMICA
CREAZIONE A FINI MEDICI DI
• MICRO-ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI
(MOGM)
• PIANTE O ANIMALI GENETICAMENTE MODIFICATI
(OGM)
• CELLULE ANIMALI IN COLTURA E
GENETICAMENTE MODIFICATE
Cellula batterica
Duplicazione cellulare
ESPERIMENTO
DI
CLONAGGIO
Gene codificante
per una proteina
(di qualsiasi
origine)
Produzione di
proteina
ricombinante
mRNA eucariotico
trascrittasi
inversa
cDNA
PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI
DI PRIMA GENERAZIONE
Proteine identiche a quelle naturali
INSULINA
ERITOPOIETINA
G-CSF
FATTORI ANTIEMOFILICI
VACCINI RICOMBINANTI
DI SECONDA GENERAZIONE
Proteine che sono state manipolate (muteine)
VACCINI RICOMBINANTI
tPA
ANTICORPI
Biofarmaci o Farmaci proteici
In un primo tempo solo come farmaci che “replicano la funzione”.
La loro attività è uguale a quella naturale.
Oppure come farmaci che bloccano la funzione (anticorpi, decoy receptors).
Le proprietà farmacologiche non sono “migliorate”
rispetto al prodotto naturale
PROTEINE RICOMBINANTI IN USO
•
Insulina umana (diabete di tipo I)
•
Ormone della crescita umano
(nanismo)
•
tPA – Attivatore del plasminogeno
(anticoagulante per il trattamento
delle trombosi)
•
Fattori della coagulazione
(emofilia)
•
Molecole antivirali (interferone)
•
Interleuchine (stimolatori del
sistema immunitario)
•
Eritropoietina- EPO (anemie,
doping)
PROINSULINA
INSULINA MATURA
VACCINI RICOMBINANTI
contro
Epatite “B”
Epatite “C”
Meningococco
Malaria (??)
Colera
Pertosse
DNA
…ACTAGGCCTA…
…TGATCCGGAT…
MUTAGENESI
…ACTAGCCCTA…
…TGATCGGGAT…
Gene codificante
per una proteina
(MODIFICATO)
proteina
…Ala Leu Gly…
…Ala Glu Gly…
Produzione di
proteina
Ricombinante
MODIFICATA
Mutagenesi oligonucleotide-diretta
VACCINO PER LA PERTOSSE
ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO
Mutagenesi oligonucleotide-diretta
INSULINA
INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29
oppure mutazione Pro/Asp
maggiore solubilità e minore formazione di polimeri.
Altre mutazioni per causare precipitazione a pH neutro dopo iniezione
per un rilascio graduale
Insulina per via orale
Mutagenesi oligonucleotide-diretta
Cys-less IL-2 e INF-beta
mutazioni Cys/Ser per diminuire le modificazioni ossidative
e aumentarne la stabilità
(in vivo e on-shelf stability)
His- enriched G-CSF
Introduzione di residui di His
(neutri a pH >7.2 e protonati a pH inferiori)
Diversa affinità per il recettore alla membrana o nell’endosoma.
(Trattamento di neutropenie)
Mouse
Chimeric
Humanized
ANTICORPI IN TERAPIA
• Blocco di interazioni ligando-recettore (p.e. HER2, estrogeni, TNF)
• Blocco di funzioni proteiche (p.e. oncogeni)
• Stimolo di segnalazione intracellulare (p.e. apoptosi)
(sia anticorpi interi che frammenti)
• Reclutamento di componenti del sistema immunitario
a seguito del binding (stimolo immunità cellulare)
(anticorpi interi)
Recettore della famiglia EGFR
ANTICORPO
Herceptin (Trastuzumab)
Prima per la diagnostica
poi
Per la terapia
Anticorpi monoclonali umani ?
Eticamente non fattibile
(pericolosità ed invasività)
Messa a punto di strategie per la
produzione di
Anticorpi Monoclonali Umani
•
Messa a punto di strategie per la produzione di
Anticorpi Monoclonali Umani
1) Uso di topi transgenici nei quali
i loci germinali
delle immunoglobuline del topo
sono stati sostituiti
dai corrispondenti loci umani.
Generazione di HMab con i metodi
tradizionali dell’ ibridoma
1)
Uso di topi transgenici nei quali i locus germinali delle
immunoglobuline del topo sono stati sostituiti dai corrispondenti umani.
Generazione di HMab con i metodi tradizionali dell’ibridoma
2) Metodi per l’espressione di frammenti
anticorpali quali
Fab o scFv
di derivazione umana
scFv
Fab
Single chain Fv
Antigen binding
Fragment
(Gly4-Ser)3
2) Metodi per l’espressione di frammenti
anticorpali quali Fab o scFv
Tecnologia del phage display
Viene imitata, in vitro, la generazione di grandi
repertori di sequenze anticorpali e la successiva
selezione clonale di anticorpi specifici
LIBRARY
SPECIFICHE
O
NAIVE
IN VIVO
IN VITRO
Library fagica di tutte le
possibili combinazioni
Selezione ed espansione
con la tecnica del panning
Produzione di uno
specifico frammento
anticorpale
ANTIGENE
PEG-ilated proteins
PEG-ilated proteins
• PEGylation increases the hydrodynamic radius of a
biopharmaceutical and shields its surface towards the
periphery.
• Thus the stability of these conjugates against proteases
is increased, their immunogenicity is reduced and their
renal excretion is decelerated.
• Consequently, PEGylation secures a prolonged half-life
of the biopharmaceutical, reduces side effects and finally
increases efficiency of the therapy.
• Anticorpi e gene terapy
In genere ScFv
•
CIRCOLANTI: Secrezione di Ab da cellule geneticamente modificate,
come cellule autologhe modificate ex-vivo o eterologhe incapsulate.
•
INTRACELLULARI: Intrabodies, con sequenze di localizzazione al RER
(peptide segnale e seq. SEKDEL), al nucleo (NLS), alla membrana interna
(seq di farnesilazione)
Down-regulation di oncogeni overespressi (ErbB-2, ciclina E)
o di forme mutate (Ras, Src)
Library sintetiche
Combinazione in vitro di
VH e VL
Mutazioni random delle CDR
MUTAZIONI RANDOM
IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION
Allo scopo di
Migliorare affinità proteina ligando (CDR di frammenti anticorpali)
Aumentare la stabilità
Cambiare la specificità di un enzima
L’analisi dei mutanti è la tappa più difficile
(20n possibilità !
Per soli 7 residui = 1.2x109 possibili mutanti !).
E’ possibile la mutazione di zone ciscoscritte di una proteina
Tecnica di selezione più usata: phage display.
Error prone PCR
([Mn2+]
sbilanciamento dNTP
Analoghi di basi
Oligonuclotidi
mutati
DNA shuffling
Mutazyme® DNA Polymerase
Fig.1
MUTAZIONI RANDOM
IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION
Su anticorpi:
Mutazioni delle CDRs per migliorare affinità e selettività
Su altre proteine
(WO/2008/040758)
PEPTIDES WITH HIGH AFFINITY FOR THE PROLACTIN RECEPTOR
FIELD OF THE INVENTION
The present invention is related to variants of prolactin, which
variants binds to the prolactin receptor with higher affinity as well as
method for producing such variants.
Such prolactin variant mutations may for instance be useful for
producing prolactin antagonists for the treatment of breast cancer.
Prolactin antagonists
in breast cancer therapy
•
Prolactin (PRL) is a potent growth factor for mammary epithelium and PRL
has been associated with the development and growth of breast tumours.
Breast cancer cells often over-express the PRL receptor (PRL-R).
•
For treatment of breast cancer it is useful a PRL antagonist in order to
prevent binding of PRL to the PRL-R on the tumour.
•
PRL binds two molecules of PRL-R through two regions of one molecule of
PRL referred to as binding site 1 (BS1, high affinity ) and binding site 2
(BS2, low affinity).
•
Variants of PRL solely able to bind via BS1 will have antagonistic
properties.
MUTAZIONI RANDOM
IN VITRO MOLECULAR EVOLUTION
Mutante del TNF (proinfiammatorio)
per avere un “dominante negativo” (DN)
Non riconosce il recettore ma è capace di
formare eterotrimeri con il TNF dell’individuo
Questi eterotrimeri sono incapaci di legarsi al recettore
AZIONE ANTI-INFIAMMATORIA
Infliximab (Remicade) is a drug used to treat autoimmune diseases.
It is a chimeric MAb and it has been approved by the U.S. Food and Drug
Administration for the treatment of psoriasis, Crohn's disease, ankylosing
spondylitis, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis, sarcoidosis and ulcerative
colitis.
Adalimumab (brand name HUMIRA) is a humanized MAb

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