PROTEINE RICOMBINANTI VACCINO PER HBV TRASFORMAZIONE IN LIEVITO PROTEINE RICOMBINANTI Colture cellulari = propagazioni di cellule fuori dall’ organismo vantaggi: 1) l’ambiente extracellulare puo’ essere manipolato 2) uso di un tipo cellulare ben definito 3) grandi quantita’ di cellule 4) studio di varie funzioni cellulari Due tipi di colture cellulari: 1) colture primarie 2) linee cellulari Colture primarie • cellule derivate direttamente da un tessuto Tecnica messa a punto nel 1907: 1g Espianto di midollo spinale + Fluido linfatico Numero di divisioni limitato Cellule con assoni che si sviluppano in coltura! senescenza replicativa Neuroni in vitro con prolungamenti Linee cellulari Possono derivare da varie fonti: cellule trasformate in vitro (p.e. In seguito a variazioni di espressione di oncogeni/oncosoppressori) espianti tumorali (posti in coltura, spesso crescono indefinatamente) differentiating muscle cell line = C2C12 Vettore di espressione per cellule animali in coltura PLASMIDE BATTERICO (parte in nero) che ospita PORZIONI EUCARIOTICHE (in colore) 1) Costruzione “in vitro” del plasmide ricombinante 2) Trasformazione (inserimento) del plasmide nel batterio, per ottenerne grandi quantità 3) Trasfezione del plasmide ricombinante in cellule in coltura 4) Selezione delle cellule che hanno 5) Integrato il plasmide nel genoma 4) Espressione e purificazione della proteina G418 - GENETICIN Blocca la traduzione in tutti gli organismi LIPOFEZIONE Si utilizzano “liposomi” caricati con i vettori di espressione DOMANDA FREQUENTE: QUALE E’ LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA ? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA A RNA (RNAi) SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ALLA RICERCA DI EVENTUALI VARIAZIONI FENOTIPICHE ! siRNA Possibilità di modulare negativamente l’espressione di specifici geni Somministrazione sperimentale di siRNA FORTE RIDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ANIMALI TRANSGENICI POSSIBILI APPLICAZIONI PRODUTTIVE espressione di proteine ricombinanti nel latte di mammiferi (capre, bovini) Vettore con promotore tessuto-specifico per la ghiandola mammaria (CASEINA) PROMOTORE DI VIRUS VEGETALE PIANTE TRANSGENICHE OVERESPRESSIONE DI UNA PROTEINA NORMALE O ESPRESSIONE DI UNA VERSIONE MUTATA (p.e. proto-oncogene attivato) Trasfezione di cellule in coltura Animali transgenici ABOLIZIONE DELL’ESPRESSIONE DI UNA PROTEINA (p.e. malattie genetiche, oncosoppressori) RNAi in colture cellulari o in C.elegans Topi knock out MODELLI PER RICERCHE DI BASE MODELLI PER MALATTIE UMANE RIASSUMENDO … CLONAGGIO DI ANIMALI Non è tecnologia del DNA ricombinante
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