Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma STAYFRESH Controllo e monitoraggio della sicurezza e qualità Chiara Gorni, Donatella Allemand, Paola Mariani Convegno Conclusivo – La valerianella di IV gamma, Milano, 4 Novembre 2014 Prodotti di IV gamma: specificità Alimenti vegetali freschi (orticoli e frutticoli) sottoposti a minime lavorazioni che pur mantenendo invariate le caratteristiche organolettiche e sensoriali del prodotto fresco permettono di ottenere un prodotto pronto da consumare e semplice da utilizzare L’umidità dell’imballaggio è condizione favorevole allo sviluppo di microorganismi La bassa temperatura, come antimicrobico, é difficile da mantenere in continuo e microrganismi possono svilupparsi Microrganismi patogeni per l’uomo possono moltiplicarsi fino a livelli di rischio per i consumatori 2 Origine della contaminazione I patogeni più rilevanti per la IVgamma sono a trasmissione oro-fecale (connessi alla sfera animale), ma fonti dirette e indirette sono presenti in ogni fase del percorso dal campo alla tavola: pre-raccolta: suolo, acqua, concimi organici non ben compostati, contatto animale (incluso umano) raccolta: contatto umano e di altri animali, attrezzature di raccolta, contenitori e mezzi di trasporto, acqua post-raccolta: contatto umano, ambiente di lavorazione, contenitori e mezzi di trasporto, contaminazioni trasversali tra prodotti in fase di consumo 3 Fonti di contaminazione: batteri patogeni Microrganismi patogeni (contaminanti occasionali) Batteri: Salmonella sp, Escherichia coli (O157:H7), Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Shigella sp, Aeromonas hydrophila Virus: epatite A, Noravirus Salmonella, Listeria ed E. coli O157:H7 sono i patogeni più comuni 4 Controllo e sicurezza: i test I test possono essere sia di tipo microbiologico classico che molecolare (DNA) Limiti dei test attualmente in commercio: • tempistiche superiori alle 24-48h • limitato numero di patogeni identificati per test (test monopatogeno) • identificazione solo a livello di specie • matrice da analizzare 5 Test molecolare multipatogeno Il test mira ad identificare simultaneamente la presenza dei seguenti patogeni: • Salmonella spp. • Listeria spp. • Escherichia Coli Il test consente anche di discriminare tra i diversi ceppi di questi patogeni, in modo da poter rintracciare la fonte della contaminazione La sensibilità del test e le sue tempistiche di identificazione, in presenza di patogeni multipli, deve essere rispondente alla normativa vigente 6 Illumina GoldenGate 7 Disegno del test Polimorfismi per i geni maggiormente informativi sono stati identificati mediante ricerca in banca dati e sequenziamento di ceppi commerciali Sono state selezionate 144 sequenze per il disegno delle sonde ma alcune sono state scartate per motivi tecnici Il pannello finale comprende 106 sonde: • 50 per Salmonella • 18 per Listeria • 38 per Escherichia Coli 8 Ceppi batterici identificati SALMONELLA agona gallinarum miami anatum hadar derby reading typhi rubislaw typhimurium montevideo senftenberg typhisuis stanleyville virchow heidelberg muenchen enteritidis mbandaka tennessee weltevreden dublin indiana naestved paratyphi A paratyphi B thompson wien duisburg infantis pullorum livingstone emek tilene ESCHERICHIA COLI O157 O111 O103 O145 O26 LISTERIA ivanovii seeligeri monocytogenes grayii monocytogenes Div. I monocytogenes Div. II monocytogenes Div. III 9 Validazione del test 157 ceppi batterici, di campo o provenienti da ceppoteche commerciali, sono stati testati con il pannello Illumina: • 98 ceppi di Salmonella • 18 ceppi di Listeria • 41 ceppi di Escherichia Coli È stata verificata: • ripetibilità • qualità estrazione del DNA La sensibilità del test è stata valutata per: • numero minimo di CFU/ml rilevate • numero di patogeni rilevati contemporaneamente 10 Risultati della validazione Le ibridazioni con i singoli ceppi batterici hanno mostrato la specificità delle sonde disegnate Utilizzando sia estratti crudi che estrazioni di DNA con kit, i dati ottenuti sono risultati confrontabili tra loro + = + La ripetibilità del dato viene a mancare nel caso di contaminazioni inferiori a 20 CFU/ml o di miscele di DNA ottenute da più di 5 ceppi batterici 11 Limiti e prospettive L’approccio tecnologico del test multipatogeno utilizzando la tecnologia GoldenGate, mostra tuttavia limiti di tempistiche (da campione ad analisi conclusa > 48h) e sensibilità (>20cfu/ml) I recenti progressi nelle tecnologie molecolari permettono di ipotizzare il trasferimento delle conoscenze sviluppate ad una piattaforma maggiormente rispondente alle esigenze di un ciclo produttivo, come un lab-on-chip o un sistema miniaturizzato di next-generation sequencing (es. MinIon) 12 Test monopatogeno “completo” La normativa riguardante i patogeni alimentari richiede generalmente la rilevazione del patogeno (Salmonella spp., E.Coli, Listeria monocytogenes) senza la necessità di una loro sierotipizzazione Tuttavia nel caso di Salmonella la norma UNI EN ISO 6579 richiede, oltre all’isolamento del batterio, anche una conferma biochimica o sierologica delle colonie isolate I test attualmente in commercio non sono in grado di fornire una soluzione “tutto in uno” con tempistiche compatibili con un ciclo produttivo Il test sviluppato per Salmonella risponde a questa necessità di isolamento e sierotipizzazione con tempi di risposta che variano dalle 24 alle 48 ore 13 Razionale del test diagnostico 1. PCR per i 3 geni selezionati (InvA, SafC e FimA) 1000 900 800 700 600 500 2. Purificazione delle singole bande di interesse InvA SafC FimA 400 500 250 200 150 100 50 IAC (controllo di amplificazione interno) 4. Sierotipizzazione mediante confronto delle sequenze con database pubblici e database proprietario 3. Sequenziamento 14 Selettività: inclusione ed esclusione Test di inclusione Genere N° ceppi testati N° diversi sierotipi FimA InvA SafC Salmonella 138 67 129/138 138/138 104/138 Test di esclusione PCR per geni Inclusività 100%: tutti i ceppi testati di S.enterica presentano almeno 2/3 dei prodotti di PCR (2 geni su 3), S.bongori 1/3 dei prodotti di PCR Esclusività: 96% per il gene FimA 100% per InvA e SafC Esclusività: 100% post sequenziamento15 Accuratezza diagnostica: specificità e sensibilità • 16h a 37°C • estrazione di DNA da 1 ml • PCR per 3 geni 25 g di valerianella 1CFU S.typhimurium LT2 250 ml BHI 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1µL 3µL 5µL 1000 700 500 250 200 150 IAC 50 FimA InvA SafC Un alto grado di accuratezza diagnostica consente di rilevare in modo preciso e veritiero il microrganismo target in presenza di matrice biologica senza interferenza di 16 microrganismi non target Limite di rilevabilità 25 g di valerianella in 250ml di BHI + 1CFU S. typhimurium LT2 PCR Valerianella + S.typhimurium Valerianella Incubazione 37°C, 150 rpm, prelievi a tempi prestabiliti T=0h T=½h T=1h T=2h T=3½h T=4½h T=5½h FimA x x x x x x x InvA - - - - - - x SafC x x x x x x x FimA - - - - - - - InvA - - - - - - - SafC - - - - - - - IAC x x x x x x x 17 Protocollo sperimentale Almeno 1 banda di interesse No bande interesse No Salmonella spp Riconoscimento sierotipo 18 Sierotipizzazione in 48h in caso di sospetto positivo, risultati negativi in 24h Vantaggi Il vantaggio di questo test è costituito essenzialmente dal fornire una unica soluzione per l’isolamento e la sierotipizzazione, con tempistiche entro le 48h. Il test monopatogeno sviluppato per Salmonella può essere trasferito direttamente a laboratori di diagnostica in quanto è stato disegnato secondo le indicazioni ISO e risponde ai requisiti normativi (ISO 6579:2002, ISO 22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006) 19 Prospettive Attualmente il limite di questo test molecolare è costituito dalla presenza di falsi positivi nel caso di batteri morti. morto Utilizzo di trattamenti con molecole che “bloccano” il DNA delle cellule morte, come ad esempio il propidio monoazide (PMA) o altri specifici intercalati bloccato vivo non bloccato PMA+luce PCR Ref. Nocker et al., 2006 Amplificazione di RNA (presente solo nelle cellule vive) con tecnica NASBA (nucleic-acid sequence based amplification) vivo morto RNA NASBA 20 Grazie per l’attenzione www.progettoager.it www.stayfresh/ager.com 21
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